合成支架在代謝工程中的研究進展

尹雪，梁晨，馮玥，張賀，王宇，李玉花

東北林業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040

近年來，以環境友好型方式實現從廉價可再生的簡單化合物催化合成高附加值的復雜化合物的代謝工程迅猛發展，在未來有望成為合成化學的替代品[1-5]。然而，與生物體內的天然合成途徑相比，外源性合成途徑并不適用于合成各種各樣的目標產物。在宿主自身代謝環境中，目標產物的過度生產對其自身生存是很少有利或必需的[6]。隨著目標合成產物的結構日漸復雜，在構建多基因的從頭合成途徑過程中，一些問題也隨之而來，例如，途徑代謝物被內源性反應轉移或通過分泌而喪失，中間產物的快速擴散和降解或對宿主自身有毒害作用，底物利用率低，宿主代謝失衡影響自身生長活力等，最終導致目標產物產量降低[6]。為解決這些問題，研究人員模仿自然代謝控制機制，將途徑酶在空間上組織形成多酶復合體，通過將途徑酶共定位來提高途徑酶和代謝物的局部濃度，形成底物通道，從而提高途徑酶轉化效率，減少中間產物的積累，降低與宿主生物中其他組分的交叉反應等[7]。

1985年Bulow等受到天然多功能蛋白的啟發，第一次嘗試將大腸桿菌Escherichia coli的β-半乳糖苷酶的3′端與半乳糖激酶的5′端融合表達，成功構建了一個能催化由2個單獨酶催化完成的2個順序反應的雙功能酶[8]。之后，該研究團隊又將來自熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens的β-半乳糖激酶和半乳糖脫氫酶融合表達，將乳糖水解為半乳糖后，再將半乳糖氧化為乳酸，并且融合后的雙功能酶與游離酶相比，反應效率提高了1.5–2.4倍[9]。該策略通過基因融合的方法將酶在空間上拉近，產生底物通道作用，實現催化效率的提高，已經廣泛地應用到其他研究中[10-13]。盡管多酶融合表達是一種極簡單且高效的多酶組裝策略，但在實際應用中仍然存在一些不確定因素和限制，例如，蛋白質的錯誤折疊或形成包涵體表達，導致酶催化活力降低甚至喪失等[14-16]。而且該策略不易應用于兩個反應以上的代謝途徑，并且由于融合蛋白的固定比例表達而不能平衡途徑酶的化學計量數。為了能使途徑酶化學計量達到平衡狀態，減少中間產物的積累，提高酶催化效率，合成生物學家采用更加模塊化的方法，使用合成生物支架的策略使途徑酶在空間上共定位，順序催化代謝反應[17]。與融合蛋白策略不同的是，合成支架是利用不同相互作用結構域或物理螯合的方式使途徑酶共定位的一個非催化亞單位，通過控制合成支架中結合結構域的位置和比例對途徑酶的化學計量數進行優化平衡，能夠靈活地應用于多個酶催化的代謝途徑[18]。

合成支架具有調節途徑酶達到最優催化效率的巨大潛在優勢，推動了近些年生物學家對合成支架的開發利用。合成支架多是截取從自然界發現的具有相互作用的生物元件構建而成，特別是基于蛋白質的支架[19]。而近年來，隨著核酸納米技術的發展，研究人員除了蛋白支架外，還開發出利用核酸作為合成支架的策略[20-24]。本文基于合成支架的最新研究進展，對其在合成生物學中解決代謝通量平衡發揮重要功能的原理進行詳細闡述，并對其應用前景作了初步探討。

1 蛋白支架

在生物進化過程中，存在許多利用酶復合物提高代謝途徑通量的自然實例。色氨酸合酶就是其中具有代表性的例子，其由線性排列的4個亞基αββα組成，通過形成分子內隧道，使中間產物直接從一個酶亞基的活性中心傳遞到下一個酶亞基的活性中心，減少中間產物的擴散或被細胞內其他組分降解，從而提高催化反應速率，類似的酶還有氨甲酰磷酸合酶和谷氨酰胺磷酸核糖基焦磷酸酰胺基轉移酶[25-28]。而另一個典型的例子就是厭氧纖維素分解菌的天然纖維小體，由纖維素酶、半纖維素酶等水解酶以及蛋白支架構成[29-30]。其中，蛋白支架是由包含重復序列的粘連蛋白(Cohesion) 組成的一個非催化亞單位，含有重復序列的錨定蛋白 (Dockerin) 與酶相連，通過cohesindockerin的相互作用將纖維素酶、半纖維素酶等水解酶固定實現多酶復合體的組裝，使多種水解酶與底物緊密接觸，提高底物局部濃度并確保酶的正確化學計量和順序，從而最大限度發揮酶的協同作用。因此，由蛋白支架組裝的多酶復合體的催化效率比游離的可溶性酶的催化效率高。

受到這種天然蛋白支架的啟發，研究人員構建人工合成的蛋白支架來提高酶的催化效率[31-33]。蛋白支架是截取天然蛋白質具有相互作用的結構域 (即受體結構域) 融合表達構建而成，通過將相應蛋白配體與途徑酶融合表達，利用蛋白質-蛋白質相互作用將途徑酶固定在蛋白支架上，然后通過調節受體結構域的比例和順序，平衡相關途徑酶的化學計量數，從而實現代謝途徑通量的增強。Tsai等利用特異的cohesin-dockerin相互作用在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae細胞表面組裝外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的多酶級聯反應，實現了纖維素水解與乙醇生產相結合，乙醇的產量相對于通過游離酶混合物催化方式高出2.6倍以上[31](圖1)。類似的，在甲醇氧化脫氫生成二氧化碳的反應過程中，利用蛋白支架將反應過程中的3種NAD+依賴的脫氫酶組裝在酵母細胞表面，催化多酶級聯反應，形成底物通道，使NADH的產率提高了5倍[33]。

在硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus中發現的環狀的異源三聚體的細胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 也被用作體外多酶組裝的蛋白支架，將假單孢氧還蛋白還原酶 (Putidaredoxin reductases，PdR)、假單孢氧還蛋白 (Putidaredoxin，PdX) 和細胞色素P450(Cytochrome P450，P450cam) 的N末端分別與PCNA的3個亞基的C末端融合，得到融合蛋白PCNA1-PdR、PCNA2-PdX和PCNA3-P450cam，在E.coli中表達純化后，利用PCNA 3個亞基間的相互作用通過體外混合的方式實現3個酶的組裝，產生更為有效的電子傳遞系統[34]。隨后，又通過結構信息分析在PCNA亞基間特異地引入二硫鍵，使蛋白支架間的結合更為穩定，相比于非共價鍵結合形成多酶復合物的方式使得P450cam反應效率增強[35]。

除了上述用于體外反應途徑的蛋白支架之外，體內增強代謝通量應用最多的人工蛋白支架是Dueber等截取后生動物信號蛋白相互作用域融合表達構建而成的蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z[36](圖2A)。他們將甲羥戊酸途徑中的乙酰乙酰-輔酶A硫解酶 (Acetoacetyl-CoA thiolase，AACT)、羥甲基戊二酸-輔酶A合成酶 (Hydroxy-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)、羥基-甲基戊二酰-輔酶A還原酶 (Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)分別與3種多肽GBD、SH3、PDZ的配體融合，然后將這3種融合蛋白與其可以特異性結合的蛋白支架在E.coli中共同表達。使用阻遏子平衡蛋白支架和酶的表達水平，通過調節蛋白支架的比例和順序對酶的化學計量數進行優化，最終當蛋白支架比例x∶y∶z為1∶2∶2時，甲羥戊酸的產量與無支架的酶催化相比提高77倍。該課題組還將此蛋白支架應用于葡萄糖到葡萄糖酸的反應途徑中，且當蛋白支架比例x∶y∶z為1∶4∶4時，葡萄糖酸的產量提高5倍[37]。隨后，Agapakis等利用該支架使產氫氣反應速率提高3倍[38]，Baek等[39]利用該支架共定位丁酸合成途徑中的酶，使丁酸產量提高3倍。并且，蛋白支架(GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z還被成功地應用于白藜蘆醇在真核生物S.cerevisiae的生物合成途徑中，通過對途徑酶進行組裝，最終白藜蘆醇的產量與組裝前相比提高5倍，與融合蛋白策略相比提高2.7倍[40]。除此之外，研究人員還將單獨的支架蛋白及其配體分別與途徑酶融合表達，催化組裝2個酶的級聯反應，達到了提高目標產物產量的目的[41-44]。盡管蛋白支架提高途徑代謝通量的確切機制尚不清楚，但據推測，由于酶的寡聚作用，使其可能形成大型復合物，類似于天然存在的代謝物微區，復合物中生成的中間體在擴散之前就很快被復合物中的酶所消耗[17](圖2B)。蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z的實際應用不僅證明了其普遍適用性，還顯示出不同合成途徑優化的最佳支架結構比例會有所不同，這對如何合理設計具有預期功能的蛋白支架提出挑戰。

圖2 蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z介導多酶組裝示意圖[17,36]Fig.2 Schematic diagram of protein scaffold (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z-mediated multi-enzyme assembly[17,36].(A) The synthetic scaffolds were constructed with three modular protein-protein interaction domains (GBD, SH3, and PDZ),which recruit three mevalonate biosynthetic enzymes (AACT, HMGS, and HMGR) C-terminally tagged with peptide ligands specific for these interaction domains[36].Local concentrations of intermediate and enzymes are elevated to improve reaction fluxes and balance kinetic parameters, in part by changing the number of repeats of these interaction domains (x, y, z) [36].(B) Enzymes with oligomeric structures could potentially bind multiple scaffolds, resulting in enzyme-scaffold complexes[17].

親和體 affibody分子由金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus蛋白A的免疫球蛋白結合區域衍化而來，含有58個氨基酸殘基，其相對分子質量小、折疊速度快、特異性親和力很高，是一種類似于抗體的親和配體[45]。Tippmann等利用affibody分子來標記途徑酶，抗獨特型affibody作為基礎來設計蛋白支架，利用affibody-抗獨特型與affibody間高特異性親和力結合使途徑酶共定位，提高反應速率[46]。在S.cerevisiae體內利用該蛋白支架體系共定位法尼基二磷酸合酶和法尼烯合酶，使法尼烯產量提高135%。通過對affibody分子的受體結合部位進行隨機重組構建噬菌體展示文庫，可以產生許多不同的高親和力的affibody分子，其能夠與相應的蛋白質分子 (即抗獨特型affibody) 特異性結合。因此，由affibody分子和抗獨特型affibody為基礎構建的蛋白支架有望應用于涉及更多酶促級聯反應的代謝途徑。

應用蛋白支架提高代謝通量，可以從以下幾個方面入手：1) 在支架配體與途徑酶融合表達時，二者之間需引入一段接頭序列 (Linker，即連接肽)，多選用柔性Linker (如 (GerSer)n)，降低支架配體與途徑酶之間的空間位阻，更有利于融合蛋白各個結構域的正確折疊。2) 考慮到支架配體與途徑酶融合表達后，是否會對途徑酶的表達及活性造成影響，可以對其酶動力參數進行鑒定。3) 在構建含有多個重復的配體結合結構的蛋白支架時，可以利用含有相同粘性末端的限制性內切酶進行設計連接[47]。4) 將蛋白支架應用于體內代謝途徑時，除了對蛋白支架比例和位置進行優化，還可以采用誘導型啟動子或阻遏子對途徑酶及蛋白支架的表達量進行控制，從而減輕宿主的代謝負擔[36,40]。

2 核酸基支架

盡管合成蛋白支架在介導多酶級聯反應、改善代謝通量等方面的研究取得了一定進展，但隨著目標代謝產物的結構越來越復雜，途徑酶的種類及分子量的增加，導致含有多個重復的配體結合結構域的蛋白支架可能會難以表達。而近年來，隨著核酸納米技術的發展，核酸分子作為遺傳信息的載體，具有以下優勢：1) 具有堿基互補配對原則，并且有了一定深入的研究[48]。2) 通過雜交(DNA-DNA/DNA-RNA/RNA-RNA) 或鋅指蛋白(Zinc-finger protein，ZFP) DNA結合結構域或類轉錄激活因子 (Transcription activator-like effectors，TALEs) 的DNA結合結構域，可以提供DNA/RNA-蛋白質的相互作用。3) 核酸分子短鏈可折疊成各種結構或組裝成二聚體或多聚體構件[49]，從而可以合成各種具有特定的可編程的三維空間結構[50-52]。4) 在納米級精度下核酸的二級和三級結構可以用計算機模擬[53-55]，而一些計算機工具的開發也促進了核酸納米結構的合理設計[56-58]。所以，研究人員開發了基于核酸分子構建合成支架，對途徑酶進行組裝的新技術[59-60]。

2.1 DNA支架

DNA支架主要分為兩種類型，其一是用含有與DNA支架互補的特異核苷酸序列對途徑酶進行化學修飾，然后利用堿基互補配對原則使途徑酶結合到DNA支架上，以提高酶促反應速率，但這種類型的DNA支架只能應用于體外反應途徑；其二是將途徑酶與含有DNA結合結構域的蛋白進行融合表達，通過DNA結合結構域將途徑酶固定在DNA支架上，實現途徑酶的共定位，其主要應用于體內代謝途徑。目前，已經有許多成功的范例將DNA支架應用于多酶體系的組裝。

2009年，Wilner等利用滾環擴增技術 (Rolling circle amplification，RCA) 合成具有特異序列的單鏈DNA，并且用含有與特異序列互補的DNA寡核苷酸以共價連接的方式分別對葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOx) 和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP) 進行化學修飾，體外利用堿基互補配對使GOx和HRP結合到單鏈DNA支架上，形成雙酶復合物激活級聯反應，而在沒有DNA支架存在的情況下則不能激活雙酶級聯反應[61](圖3A)。這證明了DNA作為分子支架將酶有序組裝的可行性。然而，盡管此方法用于多酶組裝是可行的，但是單鏈DNA缺乏剛性可能導致支架的折疊，為了增加一維DNA支架的剛性，該研究團隊還設計了二維DNA支架。預先設計一組具有部分互補序列的單鏈DNA形成六邊形結構，其具有10 bp突出的特異DNA寡核苷酸序列，可以與帶有特異序列互補的DNA寡核苷酸序列修飾的GOx和HRP通過堿基互補配對，附著到兩個不同的六邊形上[62]。當酶間距由4個六邊形 (~33 nm) 縮短為2個六邊形(~13 nm) 時，觀察到產物的量有顯著增加，研究表明這種酶催化效率的提高不僅是由于酶間距縮短使局部中間產物濃度升高而實現，還是由于中間產物在酶表面擴散受限而導致，而二維-DNA折紙結構也觀察到了相似的結果[22,62](圖3B)。隨后，Fu等利用可編程的DNA納米結構構建了具有NAD+輔酶擺動臂的DNA雙交聯拼貼支架，體外介導了6-磷酸葡萄糖脫氫酶 (Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6pDH) 和蘋果酸脫氫酶 (Malicdehydrogenase，MDH) 的兩步脫氫級聯反應[21](圖4)。通過利用DNA納米結構的可編程性，可以對酶間距、位置及化學計量數進行調節，來獲得最優結果[63]。還有其他的大的超分子DNA支架和DNA折紙同樣可以用來介導多酶級聯反應，來加快其反應速率[64-67]。但在體外將特異的寡聚核苷酸序列與途徑酶的賴氨酸殘基共價連接的化學修飾技術，成本較高并且會對酶的活性造成損壞，降低了這些策略的可行性與應用的普遍性。

圖3 多維DNA支架結構示意圖[61-62]Fig.3 Schematic diagram of multi-dimensional DNA scaffolds[61-62].(A) Linear one-dimensional single-stranded DNA scaffold synthesized using the rolling circle amplification (RCA).The two enzymes (GOx and HRP) were chemically conjugated with oligonucleotides to bind onto specific sites on the linear DNA scaffold[61].(B) Assembly of the GOx and HRP enzymes on the two-hexagon and four-hexagon two-dimensional DNA scaffolds through strands with partial complimentarity[62].

而如何將DNA支架的體外模型應用于體內環境又對研究人員提出了一項新的挑戰。對于體內應用來說，任何化學修飾的使用都不切實際。為避免化學修飾技術的使用，研究人員開始利用核酸結合蛋白與核苷酸序列特異性結合的特征實現對途徑酶的組裝。鋅指蛋白 (ZFP) 具有特異性識別核苷酸序列并與之特異結合的能力[68]，Conrado等將ZFP與質粒DNA支架結合使用，實現了在E.coli體內的合成代謝途徑的增強[69]。通過將相應ZFP與途徑酶基因融合，然后在ZFP的DNA結合結構域與質粒DNA支架相應鋅指結合位點的驅動下，途徑酶就會結合到DNA支架的相應位置上，從而介導多酶級聯反應，實現合成代謝途徑的增強。該支架的優勢在于可以通過改變鋅指結合位點的間距、數量和順序對途徑酶的組裝進行優化。質粒DNA支架介導的合成代謝途徑具有更多的代謝物生成與普遍性應用，使白藜蘆醇、1,2-丙二醇、甲羥戊酸的產量分別提高5倍、4.6倍、2.5倍[24](圖5)，L-蘇氨酸的生產時間縮短50%以上[69]。除此之外，ZFP與DNA支架的結合使用還可以介導纖維素水解轉化為其他化合物的反應[70-71]。質粒DNA支架具有可以容納多個互作基序和可變間距、無需考慮溶解性等問題的優勢，但卻需要多個鋅指結構域 (約90–120個氨基酸殘基) 對途徑酶進行修飾，并且細胞內DNA支架的最大濃度受到最大質粒拷貝數的限制。

與ZFP相比，以類轉錄激活因子 (TALEs) 為基礎的DNA結合模塊具有更高的序列特異性，較低的非靶位點結合能力和細胞毒性，并且設計操作更簡便。Zhu等利用TALE構建了人工TALE-DNA支架，體內將途徑酶與TALE基因融合，通過TALE的DNA結合結構域與DNA支架特異性結合，形成多酶復合體，用于增強E.coli中異源合成吲哚乙酸 (Indole-3-acetic acid，IAA) 途徑[72]。TALE是植物致病菌黃單胞菌Xanthomonas的一類天然細菌效應因子，與原核細胞具有實質相容性，因此該支架更適用于整合到原核生物體內。此外，TALE-DNA支架相較于其他支架體系還具有更高的穩定性，不易被降解或與細胞內其他組分發生相互作用。

圖4 輔酶擺動臂-DNA雙交聯拼貼支架結構示意圖[21]Fig.4 Schematic diagram of coenzyme swinging arm/DNA double-crossover tile scaffold[21].The NAD+-modified swinging arm is positioned halfway between two the dehydrogenases (G6pDH and MDH), facilitating the transfer of hydrides.

2.2 RNA支架

非編碼RNA (Non-coding RNA，ncRNA) 也同樣可以作為構建合成支架的材料，其可以在細胞內大量表達，且在細胞核外穩定存在。但由于具有高度特異性結合親和力的RNA結合結構域較少，所以RNA支架很難采用與DNA支架相同的構建策略。因此，研究人員選用RNA適配體作為途徑酶的結合位點，利用構建順序對稱RNA元件的策略在細胞內建立RNA的等溫線組裝方法，構建了基于具有二聚化和聚合結構域的RNA的離散型、一維和二維RNA支架，并已經用于體內經由[FeFe]-氫化酶和鐵氧還蛋白催化的產氫途徑的優化[23](圖6)。通過將與RNA適配體靶蛋白融合的[FeFe]-氫化酶和鐵氧還蛋白招募到具有RNA適配體的離散型、一維和二維RNA支架上，使E.coli內產氫量比無支架菌株有不同程度的增加，分別為4倍、11倍和48倍。這一結果顯示，隨著RNA支架維度的增加，其級聯反應速率加快所產生的產物濃度呈指數級增加。

圖5 鋅指蛋白-質粒DNA支架介導的大腸桿菌代謝途徑中的酶組裝[24]Fig.5 Zinc finger protein-plasmid DNA scaffold assisted assembly of metabolic pathways in E.coli[24].Schematic of different scaffold arrangements used for the two- or three-enzyme pathways producing resveratrol, 1,2-propanediol or mevalonate.E1, E2 and E3 are the biosynthetic pathway enzymes, a, b and c are Zinc finger domains, respectively.Scaffolds are plasmids with different zinc finger binding sites.

圖6 RNA支架介導的途徑酶的組裝[23]Fig.6 RNA scaffold-mediated pathway enzyme assembly[23].Pathway enzyme A and B scaffolded onto discrete, 1D,and 2D RNA assemblies.

同樣的RNA支架策略也被用來優化在E.coli中異源表達酰基-ACP還原酶 (Acyl-ACP reductase，AAR) 和醛去甲基化加氧酶 (Aldehyde deformylating oxygenase，ADO) 生產十五烷的代謝途徑[73]。與無支架菌株相比，二維RNA支架使十五烷產量提高2.4倍。研究人員發現，RNA適配體莖環長度的改變會引起AAR與ADO活性位點空間方向的變化，從而影響代謝途徑的產量，說明了利用RNA支架使途徑酶共定位時，酶活性中心的相對空間取向也十分重要。迄今為止，使用體內RNA支架策略優化了更為復雜的4個酶催化的琥珀酸代謝途徑，使其代謝通量提高了88%，也進一步說明了該支架的實用性。該支架相較于DNA支架來說，不僅可以優化酶的化學計量數，控制途徑酶的間距和順序，還可以控制酶的空間方向[20]。而作為一種特異性識別分子，RNA適配體具有穩定性高、靶目標廣泛等優點，由此構建的RNA支架可以擴展到更復雜的代謝途徑中使用。

3 總結與展望

在代謝工程領域，合成代謝途徑本質上是多種來源的具有不同催化活性的酶整合在一起，獲得能高產目標產物的工程菌株。為此，研究人員采用多種優化策略，如密碼子優化[74]、啟動子工程[75]、核糖體結合位點優化[76]等，對代謝途徑中途徑酶的表達水平進行優化，并取得了一定的成功。合成支架策略作為補充或平行的方法，提供了模塊化且高度靈活的組裝工具，已經在代謝途徑中廣泛應用，通過翻譯后共定位途徑酶來調節其化學計量數、距離和空間取向，達到改善代謝通量的目的。表1總結了近年來在合成支架研究領域的主要研究進展。

表1 不同類型合成支架的總結Table 1 A summary of the different synthetic scaffolds

雖然，合成支架策略在實際應用過程中取得了一定進展，但仍存在一些挑戰需要不斷地探索前進，例如如何在確保酶活性不受影響的情況下精確地控制途徑酶的間距和排列，如何挖掘具有更高特異性的合成支架相關的生物學元件，以及如何實現該技術在工業上的廣泛應用等。為克服這些挑戰，就必須更精確地了解合成支架的作用機制。合理設計具有組裝多酶功能的新型合成支架是一個復雜且涉及多學科的課題，其中包括生物物理、生物化學、計算生物學以及蛋白質工程和核酸納米技術等。相信隨著合成生物學理論和技術的快速發展，在不久的將來會開發出更高效的工程工具，用來優化天然產物合成代謝體系，從而實現復雜天然產物的工程化生產。