細菌中CRISPR/Cas系統的應用和優化

傅俊豪，楊發譽，謝海華，谷峰

溫州醫科大學 眼視光學院 眼視光學和視覺科學國家重點實驗室，浙江 溫州 325027

CRISPR作為強大的基因組編輯工具，目前在人類細胞[1]、植物[2-4]、動物[5-7]等真核生物中得到了很好的應用并取得了舉世矚目的成果。但是在細菌領域所開展的相關研究并不多。這可能是：1) 細菌中基因操作的技術相對成熟高效；2) 在大部分細菌中不存在非同源末端連接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 修復機制，因此不能對Cas9蛋白誘導產生的DNA雙鏈斷裂進行有效修復，使得以細菌自身內源性基因為靶標的DNA編輯對其造成致死性的損傷，從而限制了CRISPR/Cas技術在細菌學領域的應用[8]。本文綜述了CRISPR/Cas系統作用機制，介紹了該系統的優化及其在細菌領域的應用進展，以期為細菌基因組編輯研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統的介紹

CRISPR/Cas系統廣泛分布于幾乎所有的古菌 (約 90%) 和多數細菌 (約 50%) 中[9]。CRISPR/Cas基因座由一系列編碼Cas蛋白的基因和一個CRISPR重復間隔序列組成[10](圖1)。典型的CRISPR重復間隔序列由一段前導序列、一系列短的高度保守的正向重復序列和間隔序列順序排列組成[11]。關于CRISPR/Cas系統的詳細分類等內容，因為已經有多篇相關綜述介紹，本文將不作詳細介紹，具體請參考相關文獻[12-13]。

細菌CRISPR/Cas系統在抵御外來核酸入侵時所產生的特異性防御過程都可大致分為3個階段：適應階段；表達階段；干擾階段[14]。但不同類型系統之間也存在一定差異。以CRISPR/Cas9系統為例，當外源核酸首次入侵包含CRISPR/Cas9系統的細菌時，在Cas1和Cas2蛋白的作用下被當作間隔序列并整合到CRISPR陣列中的兩段重復序列之間，由此細菌對該外源序列產生記憶；當再次入侵時，細菌的CRISPR免疫系統開始轉錄Cas9 mRNA、pre-crRNA、tracrRNA，接著tracrRNA與pre-crRNA的部分序列通過堿基互補配對形成復合物，Cas9蛋白穩定復合物并與之形成復合體，再由RNase Ⅲ剪切該復合體產生有活性的Cas9-crRNA-tracrRNA核糖核蛋白復合物；最后成熟的crRNA與入侵的外源DNA通過堿基互補配對結合，再由核糖核蛋白復合物通過識別合適的PAM(Protospacer adjacent motif)序列定位切割的片段，并在Cas9的作用下將其剪切[15-16]。

2 CRISPR/Cas系統在細菌中的應用

2.1 對細菌基因組的編輯

研究表明，DNA結合蛋白Ku和連接酶LigD是進行非同源末端連接 (NHEJ) 修復必不可少的成分，但NHEJ相關蛋白僅存在于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等少數菌種中，因此在應用CRISPR/Cas系統編輯細菌的基因組時，需要格外考慮對雙鏈切口的修復，以防止細菌的死亡[17]。在細菌中修復切口的方式包括同源重組 (Homologous recombination，HR) 修復和NHEJ修復。因此有研究者將這兩種方式聯合CRISPR/Cas系統對細菌的基因組進行編輯。

2013年，Jiang等將CRISPR/Cas9技術與HR共同應用于基因組編輯[18]。發生同源重組的細菌因Cas9不能繼續切割靶基因得以存活，未發生同源重組的細菌則被持續切割而死亡。利用同樣的策略在拜氏梭菌[19-20]、放線菌[21-24]、解纖維梭菌[25]等菌種中均能成功實現基因編輯。白仲虎團隊利用相似的原理，在谷氨酸棒桿菌中引入HR修復的模板，對Cas9產生的DSB(Double-strand break)進行修復，實現了高效的基因缺失。另外，點突變和基因插入的效率可分別達到100%和66.7%[26]。同時，孫際賓團隊開發了一種CRISPR/Cas9介導的單鏈DNA (Single-stranded DNA，ssDNA)重組工程，可以在谷氨酸棒桿菌的基因組中精確地引入小的修飾和單核苷酸改變，效率超過了80.0%[27]。谷氨酸棒桿菌作為微生物細胞工廠，已被用于各種氨基酸的工業生產，因此這些研究為提高谷氨酸棒桿菌的生產力提供了工具。隨后，Penewit等在金黃色葡萄球菌中開發了重組工程和CRISPR/Cas9介導的反選擇條件系統，能夠在金黃色葡萄球菌基因組中有效和精確地設計點突變和大的單基因缺失[28]。

圖1 CRISPR基因座示意圖Fig.1 Diagram of CRISPR locus.

2014年，科學家在CRISPR系統中引入來自缺陷的RAC前噬菌體的RecBCD重組系統，在羅伊氏乳桿菌中成功地進行基因組編輯[29]。2015年，在CRISPR系統中引入來自λ噬菌體的λred同源重組系統也成功應用于大腸桿菌的基因組編輯中[30]。2016年，Bassalo等同樣利用λred同源重組系統，不僅提升了HR修復效率，而且提高了CRISPR系統對大腸桿菌基因組的編輯能力[31]。

除了Cas9蛋白的應用，Cpf1蛋白也被成功地作為細菌基因組編輯的工具，如楊晟團隊選用另一種效應蛋白——FnCpf1 (新兇手弗朗西斯菌Francisella novicidaCpf1，也叫Cas12a)，并結合ssDNA重組系統，成功地構建了抗L-脯氨酸反饋抑制的高產菌株[32]。

上述研究均利用了HR進行基因組編輯，然而，用這種方法進行編輯時，往往要經過一個相對復雜的DNA編輯模板構建過程，并且在大規?；蚪M編輯方面也會受到一定的限制。因此，有學者通過引入NHEJ相關蛋白來實現簡單而有效的基因組編輯。目前，利用NHEJ進行基因組編輯的研究并不多，Tong等通過共表達Cas9蛋白和LigD蛋白，利用NHEJ途徑在鏈霉菌中實現了有效的基因組編輯[22]。隨后，祁慶生團隊開發了 CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接(CA-NHEJ) 策略，該策略首先將Cas9以及來自結核分枝桿菌的保守型原核NHEJ相關蛋白轉入大腸桿菌，然后將sgRNA表達質粒通過電轉方式引入宿主菌，含有導入的NHEJ相關蛋白的宿主菌能夠修復DSB，使其在Cas9的切割中存活，并在靶位點產生突變，而野生的宿主菌則被淘汰[33]。同樣，趙國屏團隊在大腸桿菌中引入Cas9及恥垢分枝桿菌的NHEJ系統，實現了快速的基因失活或片段刪除。并且通過進一步的設計，該系統可進行連續的基因失活或DNA片段刪除[34]。因此通過引入DNA結合蛋白Ku和連接酶LigD來補救細菌的NHEJ修復途徑，可以有效地提升CRISPR系統的編輯效果。

然而，在進行HR修復或NHEJ修復時，都是在靶基因座處引入DSB作為基因校正的第一步，這很容易導致不希望的突變。因此新開發的單堿基編輯系統很好地彌補了這一缺點。季泉江團隊便把該策略引入了金黃色葡萄球菌，他們設計了 Cas9切口酶 (nCas9) 和胞苷脫氨酶(APOBEC1) 的融合體，通過過早產生終止密碼子使基因失活，從而在金黃色葡萄球菌中進行快速有效的遺傳操作，加速細菌生理學的研究[35]。同時，該課題組在假單胞菌屬物種中也實現了高效的C→T堿基編輯[36]。劉正飛團隊利用相似的策略在大腸桿菌中實現了C→T轉換[37]。鄭平團隊、孫際賓團隊和王猛團隊合作，在谷氨酸棒桿菌中開發了多元自動化堿基編輯方法，同樣實現了C→T轉換，且進行單、雙和三基因座編輯時，效率分別高達100%、87.2%和23.3%[38]。

2.2 CRISPR/Cas系統的篩選優化

對于細菌來說，外源性基因通常指從外部引入的其他物種的DNA或人工合成的DNA。一方面，包含CRISPR/Cas系統的細菌，能夠利用自身內源性的Cas蛋白對引入的外源核酸進行特異性剪切。該過程是細菌針對噬菌體等外源物質的入侵形成的一套適應性免疫防御機制[15]。正是以該機制為基礎，經過人工改造形成了新型的基因組編輯工具——CRISPR/Cas系統。

另一方面，通過引入外源CRISPR/Cas系統，實現對外源基因的剪切。該方法通常應用于對細菌基因組的編輯，用以菌株構建、基因功能研究以及對CRISPR/Cas系統的優化[19-25]。而在對外源基因進行編輯的應用中，學者們通常將其作為篩選優化的系統[39-40]。以下將從不同效應蛋白篩選優化系統的建立，進一步闡述基因組編輯在該方面的應用。

2.2.1 基于細菌的SpCas9突變體的篩選優化

目前，使用最為廣泛的SpCas9 (釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesCas9) 為野生型，它主要識別的PAMs為NGG (N為A/T/C/G)，這導致了SpCas9的應用僅限于包含NGG的序列[15,18]。Kleinstiver等利用基于細菌的陽性選擇試驗，篩選能夠識別新型PAMs的SpCas9突變體[39]。該實驗包含了兩種外源性質粒：編碼誘導型毒性基因和靶位點的報告質粒 (氨芐抗性)；Cas9/sgRNA的編碼質粒 (氯霉素抗性)。將PAM相互作用域(PI) 突變的Cas9/sgRNA質粒文庫電轉到含有報告質粒的感受態BW25141 (λDE3) 中，經過活化后涂布在含有誘導劑和氯霉素的LB固體培養基上，若Cas9實現對報告質粒的切割，就會導致毒性基因的丟失，因此細菌就能存活 (表1)。存活的克隆再進行基于人類細胞的EGFP失活試驗，最終Kleinstiver等獲得了能夠識別NGA PAMs的Cas9突變體VQR(D1135V/R1335Q/T1337R)和EQR (D1135E/R1335Q/T1337R)，以及能夠識別NGCG PAMs的Cas9突變體VRER (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)。

在此基礎上，David Liu等利用 PACE(Phage-assisted continuous evolution) 系統對SpCas9進行了進一步的篩選優化 (表1)[40]。研究者將宿主菌液持續地流過含有 SP (Selection phages) 的反應池，其中宿主菌含有誘導突變發生的質粒MP (Mutagenesis plasmid) 和激活后能表達gene Ⅲ (噬菌體存活的必需基因) 的質粒AP (Accessory plasmid)；SP可表達ω-dCas9 (無剪切活性的Cas9連接著細菌RNA聚合酶的ω亞基)。當宿主菌液流過SP時，在MP的作用下引起DNA突變，由于宿主菌液的流速比宿主菌細胞分裂快，因此宿主菌不會累積突變；相反若宿主菌液的流速比SP的生命周期慢，SP就會累積突變。SP中不同的突變，就產生了dCas9的突變體文庫。若ω-dCas9突變體能夠識別并結合到AP(含有PAM的靶序列) 上，ω亞基就能將細菌RNA聚合酶募集到靶序列下游的geneⅢ序列前，從而誘導geneⅢ的表達。由于geneⅢ是噬菌體感染所必需的，因此SP上的dCas9突變體與AP上的靶序列結合的越多，geneⅢ表達越多，噬菌體就可以更多地擴增。最終，有活性的dCas9突變體被保留下來，無活性的dCas9突變體被淘汰。David Liu等利用該策略獲得了xCas9，此突變體不僅可以識別包括NG、GAA和GAT在內的廣泛的PAM序列，而且具有更強的特異性[40]。

2.2.2 基于細菌的SaCas9突變體的篩選優化

SaCas9是一種來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Cas9酶類，其編碼序列具有比SpCas9小的特點，因此更適合用于腺相關病毒的包裝，展現了其在基因治療中巨大的潛力[41]。天然的SaCas9識別的PAM序列為NNGRRT (N為A/T/C/G；R為A/G)，預計在基因組上每32個堿基會出現一次[42]。為了拓寬SaCas9在基因組上的識別范圍，Kleinstiver等首先對SaCas9進行改造，研究者基于其之前對SpCas9突變體的篩選，采用相同的策略，將研究方向轉向了SaCas9(表1)[42]。該實驗首先根據Cas9直系同源物的蛋白質結構域比對，預測了SaCas9的PI結構域；然后對PI進行隨機突變，構建了SaCas9突變體文庫；再利用基于細菌的陽性選擇試驗和基于人類細胞的EGFP失活試驗確定目標SaCas9突變體。最終研究者成功地篩選出了名為KKH SaCas9的突變體，該突變體在包含NNNRRT PAMs的人類內源性靶位點上顯示出強大的基因組編輯活性，從而將SaCas9的靶向范圍提高了2–4倍。

2.2.3 基于細菌的Cpf1突變體的篩選優化

Cpf1屬于2類Ⅴ型CRISPR效應蛋白，與Cas9不同，Cpf1同時具有DNA和RNA內切酶活性，因此不需要RNase Ⅲ參與對pre-crRNA的加工；此外，Cas9剪切產生平末端，而Cpf1剪切產生粘性末端，因此可促進靶基因通過NHEJ方式插入靶位點[43]。野生型的Cpf1能識別富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM 序列，如AsCpf1 (氨基酸球菌Acidaminococcussp.BV3L6 Cpf1) 和LbCpf1(毛螺科菌Lachnospiraceae bacteriumND2006 Cpf1)識別的PAM序列為TTTN (N為A/T/C/G)，FnCpf1識別的PAM序列為KYTV(K為G/T，Y為T/C，V為A/C/G)[44]。

為了進一步提高Cpf1的靶向范圍，Gao等利用細菌篩選可以識別更多PAM的Cpf1 (AsCpf1和LbCpf1) 突變體，從而拓寬Cpf1的靶向范圍(表1)[45]。該研究首先構建了表達crRNA和Cpf1突變體 (大部分為單個氨基酸突變) 的質粒文庫，且質粒上帶有氯霉素抗性基因；然后用攜帶氨芐青霉素抗性基因和帶有突變PAM的靶位點的第2個質粒進行轉化，若Cpf1突變體成功識別突變的PAM且完成對靶序列的切割，就會導致氨芐青霉素抗性的丟失，結果菌落就不能在含有氨芐的平板上存活；最后將存活的菌株與Cpf1突變體文庫進行比較，確定需要的突變體。Gao等利用該方法成功篩選到了RR (S542R/K607R) 和RVR (S542R/K548V/N552R) 兩種突變體，它們能分別識別TYCY和TATV(Y為T/C，V為A/C/G)PAMs，且表現出增強的活性。

表1 CRISPR/Cas系統篩選優化策略Table 1 CRISPR/Cas system screening optimization strategy

2.2.4 單堿基編輯系統的優化

目前，科學家們主要開發了兩種單堿基編輯系統。第一種可以將C·G堿基對轉變為T·A堿基對，稱為CBE (Cytidine base editing)[46-49]；第二種可以將A·T堿基對轉變為G·C堿基對，稱為ABE (Adenine base editing)[49-52]。關于ABE對應的腺嘌呤脫氨酶，研究人員通過定向進化和蛋白質工程化改造技術對來自大腸桿菌的脫氨酶TadA進行改造，并開發了一套可以利用細菌對TadA酶進行進化的方法：首先修改抗生素抗性基因的關鍵位點，使得細菌抗生素抗性失效，作為一種選擇質粒；然后構建與dCas9融合的突變體TadA基因的質粒文庫，只有TadA酶作用于DNA并將突變位點修正后才能使得抗生素抗性基因恢復正常功能，細菌才能存活[50]。最終，研究人員獲得了理想的脫氨酶TadA突變體。ABE目前在定點的編輯 (如壓縮到只編輯1個堿基)、編輯活性、編輯窗口 (擴大編輯窗口) 等方面仍然需要強化。

2.3 對細菌基因表達的調控

對于某些高度保守且難以敲除或置換的靶基因，常?？赏ㄟ^調控基因的表達水平來達到研究的目的。其中，dCas9 (dead Cas9) 在這方面已發展為一種有效的工具。dCas9是Cas9的一種突變體，它在Cas9的兩個切割結構域 (RuvC和HNH)產生點突變 (D10A和H840A)，導致Cas9失去對靶序列的剪切作用，但保留了與DNA的結合能力[53]。dCas9通過結合到靶基因的閱讀框內或啟動子區，阻斷轉錄的延伸或干擾RNA聚合酶(RNAP) 與啟動子的結合，從而參與基因表達的調控[54-56]。由于具有與RNA干擾技術 (RNAi) 類似的作用，因此該技術又被稱為CRISPR干擾技術 (CRISPR interference，CRISPRi)[56]。有學者發現，當采用阻斷轉錄延伸的方式時，dCas9結合到非模板鏈可以達到更好的抑制效果[55-57]。目前，更多的研究是采用干擾轉錄起始的方式，當dCas9與靶基因的啟動子結合，可競爭RNAP在其上的結合位置，從而抑制轉錄的起始。研究發現，采用后者方式抑制效果更為顯著[56,58]。2013年，Bikard等將dCas9應用于肺炎鏈球菌，發現dCas9可將β-半乳糖苷酶的表達量下調14倍[54]。2015年，Choudhary等利用dCas9鑒定分枝桿菌中某些重要基因的功能[59]。2016年，Singh等利用dCas9抑制分枝桿菌中某些功能性基因的表達，從而觀察分枝桿菌表型上的變化[60]。2018年，Vigouroux等揭示指導RNA和靶標之間的互補性水平控制RNA聚合酶從靶標“踢出”dCas9并完成轉錄的速率，并且利用這種機制精確且穩健地減少細菌基因的表達[61]。

此外，dCas9還可用于上調基因的表達。將轉錄激活因子與dCas9融合后，能夠顯著提升基因的轉錄水平。該策略已成功應用于真核生物，但在細菌領域的相關報道并不多[62-66]。Bikard等將該策略應用于大腸桿菌，實現了基因的激活[54]。該研究將RNA聚合酶的ω亞基分別與dCas9的C-端和N-端融合，結果發現，當融合蛋白的結合位點處于弱啟動子的轉錄起始位點上游96 nt時，對基因的激活效果最佳。2018年，Dong等在大腸桿菌中開發了一種改進的細菌基因激活工具包[67]。他們通過CRISPR/Cas系統鑒定了幾種能夠有效激活基因表達的蛋白質，最后使用最有效的激活劑SoxS，在激活一個目的基因的同時可以用CRISPRi抑制不同的靶基因，而且可以用驅動CRISPR/Cas系統組件的誘導型啟動子控制整個多基因表達過程。但相比于dCas9對基因的抑制程度，基因激活仍有很大的提升空間。

3 CRISPR/Cas系統總結與展望

CRISPR/Cas系統作為新型的第3代基因組編輯技術，與傳統的鋅指核酸酶 (Zinc-fingernucleases，ZFN) 技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 技術相比，具有省時省力、設計簡單、編輯效率高、特異性強、對實驗技術要求低等優點。但是隨著深入的研究，該系統的缺陷也逐漸暴露，如具有較高的脫靶效應[68-69]。因此，目前的許多研究都在致力于降低CRISPR/Cas系統的脫靶效應[70]。

除了脫靶效應問題，CRISPR/Cas系統對PAM的需求也限制了其更為廣泛的應用。因此，研究人員便主張對現有的Cas蛋白進行改造，以擴大其對PAM的識別范圍。如上文所訴的各類Cas蛋白突變體，均在不同程度上擴大了野生型Cas蛋白的識別范圍。雖然目前CRISPR/Cas系統對PAM的需求已大大降低，但它仍有可改造的空間。

另外，相比真核生物，CRISPR/Cas系統在細菌及其他原核生物中的應用比較少。細菌等原核生物缺乏NHEJ修復所需的元件，可能是制約其應用的主要因素[8,22]。科學家除了通過添加NHEJ修復所需元件來降低基因組編輯的毒性外，還有學者在對藍細菌進行基因組編輯時，發現FnCpf1產生的細胞毒性比Cas9低得多[71]。因此，在對不同種類原核生物進行基因組編輯時，效應蛋白的選擇可能很關鍵。同時，單堿基編輯系統的發現為CRISPR/Cas系統在細菌中的應用提供了新的途徑。理論上，任何細菌都可以利用單堿基編輯系統來進行操作。單堿基編輯系統的逐漸成熟將為細菌等原核生物的基因組編輯提供更大的操作空間。

對于CRISPR/Cas系統來說，雖然已經取得了很多研究成果，但它仍有很大的提升空間。Cas蛋白突變體的篩選、CRISPR系統保真性的研究、單堿基編輯系統的改善、基因表達調控的應用等都需要更深入的挖掘。另一方面，由于細菌具有經濟、易培養、生長迅速等優點，因此可以大大縮短研究周期和減少開支，展現了其在CRISPR系統研究中的巨大潛力。在不斷的探索之下，CRISPR/Cas系統將會發展成為更加完善的基因組編輯工具，同時也期待它能在科學研究、臨床應用以及工農業生產中帶來更大的突破。