年齡和性別因素對健康成人面部皮膚細菌和真菌的影響

鐘彩梅 鄧裕華 周美鳳 趙偉峰廣東省佛山市順德區慢性病防治中心皮膚科 58399；南方醫科大學公共衛生學院預防醫學實驗教學中心，廣州 5055

人體皮膚表面存在大量的微生物，而微生物的存在影響了皮膚免疫系統及健康［1］。越來越多的研究［2-3］表明，年齡及性別能影響人體皮膚的健康和皮膚微生物群落的變化。年齡對人體皮膚的免疫系統有重要影響［4］；然而性別也是一些皮膚疾病發生發展的影響因素，如痤瘡多見于年輕男性，紅斑狼瘡多見于女性。另外，疾病的發生和發展，如銀屑病等免疫相關疾病，與皮膚微生物的變化息息相關［5-6］。逐漸增多的證據［5-8］也表明，皮膚微生物對皮膚免疫系統有免疫調節作用，并能影響疾病發展。目前，已有一些研究通過細菌16S rRNA測序分析了皮膚微生物組成與年齡、性別間的關系［3，9-10］，但由于不同菌種間16S rRNA具有較高的同源性且該分析只能精確到菌屬水平，故不能更準確地分析年齡和/或性別因素如何影響皮膚微生物群落的變化。我們通過宏基因組測序分析年齡和性別對面部皮膚細菌和真菌的影響。

對象與方法

一、研究對象

所有研究對象均為2017年6月至2018年6月于廣東省佛山市順德區慢性病防治中心皮膚科門診招募的無面部皮膚疾病的志愿者。納入標準：①面部無炎癥性表現（即紅、腫、熱、痛等）；②在知情的情況下簽署知情同意書。排除標準：①患有免疫性皮膚病，如系統性紅斑狼瘡、銀屑病、天皰瘡等；②患有身體其他部位的皮膚疾病可能影響或累及面部；③有吸煙史，近1個月內面部使用過抗生素、維A酸類、糖皮質激素等藥物；④妊娠期及哺乳期；⑤有高血脂、肝腎功能異常等系統性疾病；⑥近1個月內無面部手術或美容治療。按上述標準共招募36例志愿者（跖疣8例、胼胝9例、足癬10例、汗皰疹5例及甲癬4例），包括16例年輕志愿者（男9例，女7例）和20例老年志愿者（男女各10例）；年輕組年齡24～31（27.1±1.3）歲，老年組年齡61～84（75.8±2.2）歲。本研究經佛山市順德區慢性病防治中心倫理委員會及中山大學中山眼科中心倫理委員會批準（2015MEKY011）。

二、皮膚微生物樣品的采集

采用無菌有齒鑷夾住無菌MF濾膜（型號REF：HAWP01300，直徑0.45 μm；美國Merck Millipore公司）緊貼面頰部皮膚表面來回摩擦5～10次。隨即將此MF濾膜放入含有1 μl蛋白酶K和300 μl組織和細胞裂解液（兩者均來自MasterPure DNA and RNA Purification Kit，英國Epicentre公司）的無菌Eppendorf管中。樣品保存于-80℃冰箱待用。

另外，設立6個陰性對照，即含有未接觸皮膚的無菌MF濾膜及1 μl蛋白酶K和300 μl組織和細胞裂解液的無菌Eppendorf管，依據MasterPure DNA and RNA Purification Kit說明提取DNA。此外，分析文獻［11］中測序數據，主成分1（principal component 1，PC1）=46.93%，PC2=22.23%，人體兩側面部皮膚微生物的β多樣性差異無統計學意義（t=1.161，P=0.300），故采樣時面部兩側皮膚均有涉及。

三、DNA提取及宏基因組測序

皮膚微生物DNA的提取采用MasterPure DNA and RNA Purification Kit（英國Epicentre公司）。通過超聲碎裂儀（比利時Diagenode公司）將總量約100 ng DNA碎裂成長度為300～400 bp的DNA片段；然后，通過KAPA LTP文庫純化試劑盒（美國Kapa Biosystems公司）進行DNA測序文庫的構建。使用HiSeq PE Cluster V4試劑盒和HiSeq SBS V4 250 cycle試劑盒（美國Illumina公司）在IlluminaHiSeq 2500測序儀上對DNA文庫進行雙端測序。測序結束后利用軟件CASAVA v1.8.2（美國Illumina公司）對原始數據進行Fastq格式轉換。測序工作由中山大學中山眼科中心魏來教授課題組完成。

四、測序數據分析

采用軟件FastQC、Cutadapt、Fastx、PrinSeq對測序數據進行質控分析，在最終得到的高質量數據中用軟件HiSAT2（v2.0.1）和DeconSeq去除人的數據，得到不含宿主數據的高質量微生物數據。采用序列比對軟件 Burrows-Wheeler Aligner（BWA）0.7.5a在通用微生物數據庫中比對該高質量微生物數據，對成功匹配的微生物基因組進行菌種注釋，并采用RPKM法標準化計算微生物相對豐度。采用Mothur軟件計算Shannon指數（Shannon index）以評估微生物α多樣性。微生物KEGG代謝途徑的重建及其豐度的分析采用軟件HMP Unified Metabolic Analysis Network（HUMAnN2），計算微生物總體代謝途徑的相對豐度，以反映代謝途徑的活躍程度。此外，采用R軟件（v3.4.3）中Ade4程序進行基于菌種相對豐度的主成分分析（principal component analysis，PCA），計算PC1和PC2在組間的權重，并通過比較組間PC1的坐標值，反映組間物種的種類和相對豐度的差異，以評估β多樣性。采用Lefse程序計算組間差異微生物的相對豐度，通過線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）獲得各組具有代表性且差異顯著的菌種，以LDA分值的大小反映組間各物種的差異大小。

五、統計學分析

采用SPSS 17.0軟件處理。計量數據若符合正態分布，以±s表示，并采用兩獨立樣本t檢驗分析；若不符合正態分布，則以中位數M（P25，P75）表示，并采用Wilcoxon秩和檢驗分析。PCA分析中，采用兩獨立樣本t檢驗比較PC1。采用R軟件（v3.4.3）進行Pearson相關性分析，計算LDA分析獲得的有差異的細菌和真菌相對豐度的相關性。相關系數r取絕對值后，如0≤r＜0.1為無相關性，0.1≤r＜0.3為弱相關，0.3≤r＜0.5為中等相關，0.5≤r＜1.0為強相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、宏基因組測序分析健康成人面部皮膚微生物數據

分析36例志愿者面部皮膚微生物數，單樣本總測序reads數目為16.4 M～27.8 M，其中大部分數據來源于宿主人，但每個樣品可獲得2.8 M～5.1 M高質量微生物reads，占總測序reads數目的17.2%～18.6%。對6個陰性對照的測序樣品進行文庫構建、測序及分析顯示，對照數據均為重復、無效或低質量的數據，且未獲得足夠可用于分析的微生物數據，因此該數據未展示。

分析排除人數據后的高質量微生物reads數據顯示，微生物數據主要為細菌來源（93.69%±1.02%），而真菌和病毒數據僅分別占5.45%±1.09%和0.86%±0.13%。細菌主要以痤瘡丙酸桿菌為主（圖1A），而真菌以球形馬拉色菌為主（圖1B）。

二、年齡影響面部皮膚微生物群落多樣性及其代謝途徑

老年組面部皮膚細菌群落的α多樣性（Shannon指數0.98±0.07）顯著高于年輕組（0.72±0.09，t=2.201，P=0.035），見圖2A。PCA分析顯示，年齡也能顯著影響面部皮膚細菌群落的β多樣性（PC1：老年組-1.256±0.349，年輕組1.591±0.116，t=6.991，P＜ 0.001），見圖2B。此外，選取相對豐度≥1%的細菌進行差異及相關性分析，痤瘡丙酸桿菌及球形馬拉色菌相對豐度年輕組（91.29%±1.71%、75.69%±3.97%）均顯著高于老年組（74.87% ±4.38%、52.31% ±2.72%；t=3.101、5.004，P=0.004、＜ 0.001），且與年齡呈負相關（r=-0.51，P=0.002）；而老年組面部皮膚綠膿假單胞 菌（Pseudomonas aeruginosa，t=3.998，P＜0.001）、藤黃微球菌（t=2.359，P=0.033）、野油菜黃單胞菌（t=3.003，P=0.005）、食酸叢毛單胞菌（t=4.510，P＜ 0.001）、大腸埃希菌（t=4.332，P＜0.001）、施氏假單胞菌（t=2.222，P=0.033）、人蒼白桿菌（t=3.525，P=0.001）、鮑氏不動桿菌（t=5.124，P＜ 0.001）、惡臭假單胞菌（t=3.825，P＜0.001）、致黑嗜熱菌（t=5.754，P＜0.001）和伯氏食酸菌（t=4.623，P＜0.001）的相對豐度均顯著高于年輕組（圖2D），且這些細菌的相對豐度與年齡呈正相關（r=0.79、0.56、0.71、0.75、0.80、0.75、0.83、0.71、0.68、0.81、0.83，均P＜ 0.001）。

此外，年齡因素還會影響面部皮膚真菌群落的結構。老年組面部皮膚真菌的α多樣性（Shannon指數1.11±0.05）顯著高于年輕組（0.81±0.05，t=3.836，P＜0.001），見圖2A。PCA分析顯示，面部皮膚真菌群落的β多樣性亦受到年齡因素的影響（PC1：老年組-2.006±0.234，年輕組2.508±0.323，t=11.591，P＜0.001），見圖2C。選取相對豐度 ≥1%的真菌進行差異及相關性分析，年輕組球形馬拉色菌（t=5.004，P＜0.001）和費氏新薩托菌相對豐度（t=3.068，P=0.004）顯著高于老年組，且這兩種真菌豐度與年齡呈負相關（r=-0.63、-0.48，P＜0.001、=0.004）；而老年組萊布爾氏菌（Albugo laibach，t=3.823，P＜ 0.001）、黃曲霉菌（t=13.46，P＜0.001）、柄籃狀菌（t=4.629，P＜0.001）和馬爾尼菲塔拉霉菌相對豐度（t=2.479，P=0.018）更高，且與年齡呈正相關（r=0.57、0.86、0.60、0.41，均P＜0.05），見圖2E。

圖1 宏基因組測序分析不同年齡及性別健康志愿者面部皮膚微生態結構 1A：各樣品中細菌的相對豐度以痤瘡丙酸桿菌為主；1B：各樣品中真菌的相對豐度以球形馬拉色菌為主

LDA分析得到一些具有代表性的菌種，老年組20種細菌、17種真菌的相對豐度高于年輕組，而年輕組僅痤瘡丙酸桿菌和6種真菌的相對豐度高于老年組，見圖3A、3B。

老年組細菌代謝途徑的活躍程度明顯低于年輕組（t=1.995，P=0.020），見圖4A。同時，HUMAnN2軟件計算KEGG代謝途徑數據顯示，年輕組真菌基因的相對含量（0.000 427%±0.000 050%）顯著高于老年組（0.000 272%±0.000 048%，t=5.058，P＜0.001），見圖4B。年輕組真菌代謝途徑活躍程度亦顯著高于老年組（0.000 263±0.000 103比0.000 065±0.000 026，t=2.464，P=0.025），其中分支酸合成途徑（t=3.810，P=0.002）、戊糖磷酸途徑（t=2.341，P=0.033）、乙酰輔酶A合成（t=3.093，P=0.007）、二磷酸鳥苷-甘露糖生物合成（t=3.077，P=0.077）、核糖體生物合成（t=3.344，P=0.004）、有氧呼吸途徑Ⅰ（t=5.088，P＜0.001）等代謝途徑在年輕組中的活躍程度顯著高于老年組，見圖4B。

三、性別因素對面部皮膚微生物群落的影響

忽略年齡因素，細菌群落的α多樣性（Shannon指數：男性組0.83±0.08，女性組0.92±0.09，t=0.801，P=0.430；圖5A）和真菌群落的α 多樣性（Shannon指數：男性組0.92±0.06，女性組1.04±0.05，t=1.332，P=0.192；圖5A）及β多樣性（PC1：男性組0.159±0.577，女性組-0.224±0.639，t=0.439，P=0.663；圖5B）均未受到性別影響，但細菌群落的β多樣性受性別因素影響（PC1：男性組0.521± 0.319，女性組-0.659± 0.559，t=2.149，P=0.020；圖5C）。同時，細菌（男性組：0.000 076±0.000 015，女性組：0.000 091 ± 0.000 015，t=0.895，P=0.378）和真菌（男性組：0.000 098±0.000 021，女性組：0.000 109 ± 0.000 022，t=0.483，P=0.631）的代謝途徑也未受到性別因素的影響。LDA分析顯示，男性與女性組間少數細菌的相對豐度不同（表1），其中女性組面部皮膚綠膿假單胞菌、嗜熱鏈球菌、鮑氏不動桿菌、伯氏食酸菌、嗜麥芽窄食單胞菌、乳酸乳球菌、皮氏羅爾斯頓菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱棲熱菌相對豐度更高（均P＜0.05），而男性組施氏假單胞菌和耳毛棒狀桿菌相對豐度更高（均P＜0.05）；LDA分析男女兩組間真菌相對豐度差異無統計學意義（均P＞0.05）。

圖2 年齡對健康人面部皮膚微生物多樣性及相對豐度的影響 2A：Shannon指數顯示，年齡因素可同時影響細菌和真菌群落的α多樣性；2B、2C：主成分分析法（PCA）比較老年組與年輕組細菌和真菌群落的種類及相對豐度差異，顯示年齡因素可同時影響細菌和真菌群落的β多樣性；2D：對相對豐度≥1%的細菌進行不同年齡組相對豐度差異分析，顯示老年組12種細菌相對豐度顯著高于年輕組（由于痤瘡丙酸桿菌相對豐度明顯高于以上各菌種，故未能在圖中標出）；2E：Pearson相關分析顯示，球形馬拉色菌、費氏新薩托菌相對豐度與年齡呈負相關，而萊布爾氏菌、黃曲霉菌、柄籃狀菌和馬爾尼菲塔拉霉菌相對豐度與年齡呈正相關

老年男性組與老年女性組、年輕男性組與年輕女性組間皮膚細菌群落β多樣性差異有統計學意義（t=2.255、1.954，P=0.019、0.035），而真菌群落β多樣性差異無統計學意義（t=1.050、0.705，P=0.154、0.246）；老年女性組與年輕女性組、老年男性組與年輕男性組間細菌和真菌β多樣性差異均有統計學意義（細菌：t=5.673、4.432，均P＜ 0.001；真菌：t=7.873、8.540，均P＜ 0.001），見圖5D、5E。

圖3 線性判別分析（LDA）比較老年組與年輕組間健康面部細菌和真菌的差異 采用Lefse程序計算微生物相對豐度，通過LDA獲得組間差異顯著的皮膚微生物。3A：老年組20種細菌的相對豐度高于年輕組，而年輕組僅痤瘡丙酸桿菌的相對豐度高于老年組；3B：老年組17種真菌的相對豐度高于年輕組，而年輕組僅6種真菌的相對豐度高于老年組

四、微生物之間相互影響、相互制約

相關性分析顯示，細菌與細菌、真菌與真菌，細菌與真菌之間既存在正相關關系，也存在負相關關系。其中，痤瘡丙酸桿菌與綠膿假單胞菌在老年女性組、年輕女性組和年輕男性組中呈強負相關（均P＜0.05），與表皮葡萄球菌僅在年輕女性和年輕男性組中呈強負相關（均P＜0.01）；球形馬拉色菌與萊布爾氏菌在4組中均呈負相關（均P＜0.01）。細菌與真菌之間的相互關系依舊存在，如金黃色葡萄球菌與馬爾尼菲塔拉霉菌在年輕男性和年輕女性組中均呈弱負相關（均P＜0.05），而與黃曲霉菌在年輕女性組中亦呈弱負相關（P＜0.001）；綠膿假單胞菌與馬爾尼菲塔拉霉菌在老年女性組中呈強正相關（P＜0.001），在年輕女性組中呈強負相關（P＜0.01），在老年男性組和年輕男性組中無相關性（均P＞0.05）。見表2。

討 論

目前許多研究通過16S測序分析探討年齡和/或性別對健康皮膚細菌群落變化的影響［2-3，9］，由于不同細菌種屬間16S序列有較高的同源性，因此16S測序分析只能定位到菌屬水平；而且在RDP數據庫（http：//rdp.cme.msu.edu/）中［12］，序列評估可信度≥80%才能確定細菌的菌屬。目前，國內外尚無通過18S rRNA或宏基因組分析年齡或性別因素對皮膚真菌群落影響的研究。因此，我們通過宏基因組測序，在菌種水平探討年齡和/或性別因素對健康面部皮膚細菌群落的影響。

圖4 年齡對健康人面部皮膚微生物代謝途徑的影響 4A：老年組細菌代謝途徑的相對含量明顯低于年輕組；4B：部分真菌代謝途徑在年輕組中的相對含量高于老年組（均P＜0.05）

圖5 性別對健康人面部皮膚微生物α和β多樣性的影響 5A：男女性組間細菌、真菌群落的α多樣性（Shannon指數）均無明顯差異；5B：性別因素不影響真菌群落的β多樣性；5C：性別因素影響細菌群落的β多樣性；5D、5E：主成分分析（PCA）比較年輕男性組、老年男性組、年輕女性組和老年女性組間的細菌、真菌群落β多樣性，顯示性別因素僅影響細菌群落β多樣性，而年齡因素影響細菌和真菌群落β多樣性

表1 線性判別分析比較男性組與女性組面部皮膚細菌群落相對豐度的差異［%±s或M（P25，P75）］

表1 線性判別分析比較男性組與女性組面部皮膚細菌群落相對豐度的差異［%±s或M（P25，P75）］

注：a兩獨立樣本t檢驗計算出的t值；bWilcoxon秩和檢驗計算出的Z值

細菌綠膿假單胞菌嗜熱鏈球菌鮑氏不動桿菌伯氏食酸菌嗜麥芽窄食單胞菌乳酸乳球菌皮氏羅爾斯頓菌肺炎克雷伯菌陰溝腸桿菌嗜酸乳桿菌嗜熱棲熱菌施氏假單胞菌耳毛棒狀桿菌男性組（19例）0.404±0.142 0.027（0.002，0.849）0.071±0.021 0.061±0.017 0.009（0.003，0.069）0.040（0.011，0.052）0.042±0.019 0.042±0.011 0.007（0.002，0.039）0.001（0.001，0.006）0.007±0.002 0.284±0.077 0.223±0.009女性組（17例）1.798±0.522 1.508（0.002，2.775）0.241±0.060 0.178±0.046 0.080（0.005，0.253）0.087（0.015，0.163）0.102±0.032 0.092±0.026 0.056（0.003，0.088）0.015（0.003，0.021）0.031±0.008 0.092±0.036 0.044±0.009統計量（t或Z值）2.871a-2.329b 3.013a 2.218a-2.669b-2.215b 2.108a 1.958a-2.101b-2.726b 3.296a 2.011a 1.872a P值0.007 0.020 0.005 0.034 0.008 0.027 0.042 0.018 0.036 0.006 0.001 0.036 0.035

表2 健康人面部皮膚表面細菌與細菌或真菌之間的相互關系

本研究結果顯示，健康人面部皮膚表面主要的細菌屬和真菌屬分別為丙酸桿菌屬和馬拉色菌屬，與已有研究結果相似［2-3，13］。丙酸桿菌屬以痤瘡丙酸桿菌為主，而馬拉色菌屬以球形馬拉色菌為主，它們均為皮膚正常的共生菌，在維持皮膚健康微生態結構中起重要作用。有研究者［14-15］指出，痤瘡丙酸桿菌可產生丙酸，調節皮膚表面的酸堿度，并可抑制致病性金黃色葡萄球菌和其他丙酸桿菌屬細菌的生長；同時，痤瘡丙酸桿菌還可誘導皮膚角質形成細胞發生自噬，促進細胞去除胞內無功能的線粒體，提高細胞的生存效率，從而維持皮膚的自我平衡［16］。球形馬拉色菌除了是皮膚正常菌群外，也是其他組織如鼻竇中的常見菌群［17］。有研究［18］顯示，該菌可通過分泌蛋白酶的方式減少金黃色葡萄球菌生物膜形成。可見，痤瘡丙酸桿菌和球形馬拉色菌在一定程度上有利于人體皮膚的健康。然而，本研究結果顯示，這2種微生物受到年齡因素的影響，其在健康面部皮膚表面的相對豐度隨著年齡的增加而減少，而一些病原細菌（如綠膿假單胞菌、大腸埃希菌、施氏假單胞菌和人蒼白桿菌）和病原真菌（如黃曲霉菌、馬爾尼菲塔拉霉菌）在面部皮膚上的相對豐度則隨著年齡的增加而增加。究其原因，除了與年齡的增長、人體免疫力下降有關外，可能還與皮膚微生物間相互影響、相互制約關系的變化有關。微生物間相關性分析顯示，痤瘡丙酸桿菌與綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌呈強負相關關系；球形馬拉色菌與馬爾尼菲塔拉霉菌、萊布爾氏菌亦呈中等強度以上的負相關關系。當皮膚上痤瘡丙酸桿菌和球形馬拉色菌的相對含量減少時，致病菌受到的抑制作用減弱，其相對含量可能升高。但無論我們處于哪個年齡階段，健康的皮膚微生態結構是維護健康皮膚的重要因素之一。

年齡因素同時影響細菌和真菌群落的α和β多樣性，但性別因素僅影響細菌群落的β多樣性。此外，一些病原菌如綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、施氏假單胞菌的相對豐度在男女性組間存在差異，提示性別因素對面部菌群結構及皮膚健康的影響也不容忽視。比如，系統性紅斑狼瘡多見于女性，其不同的疾病表型又可影響皮膚細菌在皮膚上的含量，如金黃色葡萄球菌在健康男性皮膚中的檢出率較女性高，而系統性紅斑狼瘡女性患者的金黃色葡萄球菌檢出率則高于男性［19-20］。

此外，年齡不僅影響了皮膚細菌和真菌的群落結構，也影響其代謝途徑。老年組細菌和真菌代謝途徑的活躍程度均較年輕組低，這可能提示老年個體的皮膚免疫能力較年輕個體弱［21-23］。有研究［24］顯示，腸道微生物與宿主腸道免疫細胞之間通過彼此的代謝產物相互影響、相互調節，共同維護健康、完整的小腸屏障功能。因此，我們推測皮膚表面的大量微生物與皮膚免疫細胞之間亦存在類似腸道的相互調節機制。即使年齡差異導致這種調節機制存在一定差異，但只要皮膚正常微生物和皮膚免疫系統之間的動態平衡未被打破，亦可形成一道天然屏障，抵御外源性病原體的入侵。

綜上所述，我們通過宏基因組數據分析闡述了年齡和性別因素對皮膚細菌和真菌的影響，為后續分析和探討皮膚疾病與皮膚微生物群落之間的關系奠定一定的理論基礎，從而更好地了解皮膚疾病的發病機制。但本研究尚存在一些不足，如各組樣本量偏少，組間年齡差距明顯，缺乏環境影響因素等，有待我們今后進一步細化各種影響因素探討微生物與皮膚疾病的發病機制。