絲膠對2型糖尿病大鼠胰腺PI3K mRNA表達的影響*

王丹丹，李東哲，史 碩，宋妤軒，陳志宏，宋成軍

（承德醫學院人體解剖學教研室，河北承德 067000）

隨著人們生活水平的日益提高和生活方式的改變，糖尿病的發病率逐年增高，威脅著人們的健康和生命安全。2型糖尿病是一種由多種原因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，目前認為其主要的病理生理機制是胰島β細胞功能障礙和胰島素抵抗，二者互相聯系、協同作用導致發病。胰島素是由胰腺的內分泌部胰島β細胞受內源性或外源性物質，如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素，是機體內唯一降低血糖的激素，也是機體內唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。大多數學者認為[1]，胰島素發揮降糖作用的主要通路為磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）信號通路。胰島素與靶細胞膜上的胰島素受體(insuliin receptor，IR)結合后，胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)被磷酸化，進而使PI3K被激活，PI3K具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性和磷脂激酶活性，可使Akt被磷酸化發揮生物效應，Akt可通過促進糖原合成、抑制肝糖原異生等調節糖類代謝[2]。作為PI3K-Akt信號通路的關鍵酶，本研究旨在探討絲膠對2型糖尿病大鼠胰腺PI3K mRNA表達的影響，為糖尿病發病機制和臨床治療的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及處置 36只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司的SPF級雄性SD大鼠(合格證號SCXK（京）2012-0001)，隨機分為3組：正常對照組、糖尿病模型組和絲膠治療組，每組12只。糖尿病模型組和絲膠治療組大鼠均以高脂高糖飼料喂養聯合鏈脲佐菌素(35mg/kg，2次)腹腔注射的方式建立2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖≥11.1mmol/L作為成模標準。模型建立成功后，絲膠治療組大鼠給予絲膠（2.4g/kg/d）連續灌胃35天，正常對照組和糖尿病模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃35天。

1.2 絲膠的制備 1% Na2CO3浸泡蠶繭30min（浴比1：30），然后于95～100℃沸煮3h（2次），2次提取液減壓濃縮后用8000～14000nm透析袋透析過夜，透析液冷凍干燥成粉末，得絲膠。

1.3 大鼠取材 大鼠禁食12h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經心臟取血，取血后斷頭處死，迅速取出胰腺，于液氮中加入Trizol研磨后放入液氮保存。

1.4 相關指標的檢測

1.4.1 檢測血糖：所取血液于4℃、3000r/min離心20min，收集上層血清。采取葡萄糖氧化酶法檢測血糖水平。

1.4.2 檢測胰腺PI3K mRNA的表達：取胰腺組織提取總RNA后，反轉錄為cDNA；擴增PI3K和GAPDH，得到標準曲線、擴增曲線及溶解曲線。引物序列及產物長度見附表（引物的設計與合成由寶生物工程（大連）有限公司完成）。以PI3K和GAPDH拷貝數的比值作為PI3K mRNA的相對表達水平。

附表 引物序列表

1.5 統計分析 采用SPSS 19.0統計軟件處理數據。實驗數據以（±s）表示，多組間樣本差異的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖 與正常對照組大鼠血糖［(10.83±2.03)mmol/L］相比，糖尿病模型組大鼠的血糖［(29.45±4.82)mmol/L］明顯升高(P＜0.05)；與糖尿病模型組大鼠相比，絲膠治療組大鼠的血糖［(13.20±4.09)mmol/L］明顯降低(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠胰腺PI3K mRNA的表達 以不同濃度梯度pMD18-T-PI3K陽性質粒DNA(4.67×107～4.67×104)和樣品cDNA做為模板，經Real Time PCR擴增，得標準曲線、擴增曲線和溶解曲線，結果見附圖。標準曲線：相關系數r=-0.998，斜率=-3.07208，截距=32.619，擴增效率為111.598%；溶解曲線呈單峰，無非特異型擴增，擴增特異性較好，表明產物單一；擴增動力學曲線呈典型的S型，樣品的擴增曲線在標準曲線范圍內。

與正常對照組(0.030±0.013)比較，糖尿病模型組大鼠胰腺PI3K mRNA(0.013±0.009)的表達明顯降低(P＜0.05)；絲膠治療組大鼠胰腺PI3K mRNA(0.030±0.010)的表達明顯高于糖尿病模型組(P＜0.05)。

附圖 Real Time Q-PCR法PI3K mRNA的表達

3 討論

2型糖尿病是胰島素抵抗的非胰島素依賴性糖尿病。胰島素抵抗是指在一定量的胰島素作用下，葡萄糖攝取和利用的效率下降，從而導致血糖濃度升高。研究表明[3]，發生胰島素抵抗的主要原因是胰島素信號通路功能障礙，而大多數學者認為[1]，PI3K-Akt信號通路是主要的胰島素信號轉導通路。

PI3K屬于脂類激酶家族，不僅能激活絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶，還能激活磷脂酰肌醇激酶。PI3K可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類，它們的結構與功能各異，其中研究廣泛并主要起作用的為I類PI3K，此類PI3K是由一個催化亞基（p110）和一個調節亞基（p85）構成的異源二聚體。I類PI3K的催化亞基有4種，即p110α、β、δ、γ，其中δ、γ分布在白細胞，而α、β廣泛分布在各種細胞。I類PI3K的調節亞基通常被稱為p85，p85含有SH2和SH3結構域，可與含相應結合位點的靶蛋白相作用。I類PI3K可進一步分為ⅠA和ⅠB兩類，IA類從酪氨酸激酶連接受體處傳遞信號，具有蛋白激酶和類脂激酶兩種活性；ⅠB類經G蛋白連接受體處傳遞信號。

PI3K家族與細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡及葡萄糖轉運等多種功能的調節密切相關，而研究發現[4]，胰島素主要通過PI3K信號通路調節蛋白質、脂肪和糖類等三大物質代謝。Zhang等[5]發現，在大鼠脂肪組織中，通過使PI3K的表達增高，可以降低胰島素抵抗；王帥等[6]認為，PI3K-Akt信號通路與2型糖尿病關系密切，它參與體內糖脂代謝。本研究發現，糖尿病模型組大鼠胰腺PI3K mRNA的表達明顯低于正常對照組，結果與上述報道一致，提示PI3K參與了2型糖尿病的發生發展。

目前，針對2型糖尿病的傳統防治方法主要包括非藥物療法、內科治療、胰腺和胰島移植等。非藥物療法和內科治療可顯著降低病死率、延長存活時間，但無法有效預防、治療糖尿病并發癥及改善糖尿病抵抗。胰腺和胰島移植方面由于難度大、并發癥發生率高、排異反應等原因，目前尚未能達到預期的效果。因此，探尋一種治療糖尿病療效可靠，且不良反應較少的天然藥物十分必要。糖尿病屬中醫“消渴癥”范疇，本草綱目書“蠶繭，甘、溫、無毒，煮湯治消渴，古方甚稱之”[7]。我國民間亦有將蠶繭開水浸泡用以控制血糖的驗方。絲膠是蠶絲中包被在絲素外圍的高分子水溶性蛋白，根據本課題組的前期研究[8]，絲膠具有降血糖的作用，且在一定程度上能預防糖尿病時血糖升高。本研究進一步研究發現，蠶繭水提物—絲膠在降低2型糖尿病模型大鼠血糖的同時，能明顯提高模型大鼠胰腺PI3K mRNA的表達。本研究結果提示，絲膠可能通過提高胰腺PI3K的表達調節胰島素PI3K-Akt信號通路，從而起到降血糖的作用。同時，絲膠是天然的蛋白質，可生物降解、對人體無毒性，因此具有良好的應用推廣前景，但其降血糖作用的相關機制尚需進一步研究與探討。