趕黃草3種提取物對小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的保護作用

范 玲， 謝星星， 陳 立， 王璐璐， 黃力強， 趙飄飄， 熊玉霞?

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

內(nèi)毒素是G-桿菌生長時釋放或死亡時裂解出來的細胞壁成分，被公認是導(dǎo)致膿毒癥、嚴重休克、多臟器功能衰竭的主要致病因子[1］。肝臟既是清除內(nèi)毒素的主要場所，也是內(nèi)毒素血癥受損最早、最明顯的靶器官之一[2］，肝損傷后對該因子的清除功能減退，輕者出現(xiàn)乏力、精神不佳、食欲不振等亞健康癥狀，嚴重者大量內(nèi)毒素在肝臟未經(jīng)解毒就溢入人體循環(huán)，引起內(nèi)毒素血癥，進而導(dǎo)致呼吸、神經(jīng)、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)等損害，甚至致死性感染性休克、多器官功能衰竭[3-4］。目前，內(nèi)毒素性肝損傷的治療措施機制比較單一，大多忽略膽紅素升高造成的繼發(fā)性肝損傷，而且未涉及自身免疫調(diào)控，綜合治療力度明顯不足，但采取多種藥物聯(lián)合使用必然會增加肝臟負荷，增加患者經(jīng)濟負擔，故開發(fā)廉價、毒副作用小、增強機體自身免疫調(diào)控、藥效良好的天然藥物成為治療內(nèi)毒素性肝損傷的重要任務(wù)。

趕黃草學(xué)名扯根菜，為虎耳草科扯根菜屬植物[5］，主要分布于我國四川、云南、貴州等地，人工栽培品以四川省瀘州古藺為道地產(chǎn)區(qū)，民間歷來作為藥食兩用植物[6］，其最主要藥理作用為保肝，對各種原因引起的肝損傷具有保護作用[7］，以趕黃草為原料制備的肝蘇顆粒在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，但目前尚無將其用于治療內(nèi)毒素性肝損傷的報道。因此，本實驗探討趕黃草在體外對內(nèi)毒素誘導(dǎo)RAW264.7細胞活化和體內(nèi)內(nèi)毒素致小鼠肝損傷的影響，為該植物應(yīng)用于臨床相關(guān)疾病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 趕黃草 （產(chǎn)地四川，批號150204-1）購自瀘州百草堂中藥飲片公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)中藥教研室孫琴教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草Penthorum chinense Pursh的全草。肝蘇顆粒購自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。脂多糖購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒購自北京安迪華泰生物科技有限公司；兔抗大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）、山羊抗大鼠凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）購自北京Santa公司；TRITC標記兔抗山羊二抗、FITC標記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）、超氧物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器 多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；高速低溫離心機購自美國Thermo Fisher公司；CO2培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；EVOS FL無目鏡熒光倒置顯微鏡購自美國AMG公司。

1.3 細胞 小鼠巨噬細胞系RAW264.7由中國科學(xué)院上海細胞庫提供，在5%CO2、37℃條件下用含10%Gibco胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，取生長對數(shù)期細胞用于實驗。

1.4 動物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（川）2013-065。小鼠在恒溫、光照周期12 h／12 h環(huán)境中飼養(yǎng)1周后建立內(nèi)毒素性肝損傷模型，實驗前24 h禁食不禁水。

2 方法

2.1 提取物制備 精密稱取粉碎趕黃草3份，分別用水、70%乙醇、95%乙醇按料液比1∶10在85℃下水浴回流提取3次，分別合并3次提取液過濾后蒸發(fā)掉大部分溶劑，收集提取液，濃縮后40℃烘干至恒定質(zhì)量，即得3種對應(yīng)提取物。

2.2 體外實驗

2.2.1 藥液配制 提取物用DMSO溶解后經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，-20℃下保存。實驗前，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度小于0.1%。

2.2.2 安全濃度測定 采用MTS法。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞密度為2×105／mL后接種于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h，吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含3種提取物的培養(yǎng)基 （400、 200、 100、 50、 25、 12.5、6.25 mg／L），空白組加含 DMSO 0.1%的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入10 μL MTS溶液，培養(yǎng)2 h后在495 nm波長處檢測各孔吸光度，實驗至少重復(fù)3次。

2.2.3 細胞分組 根據(jù)安全濃度測試結(jié)果，取對數(shù)期生長細胞隨機分為空白組、模型組（0.5 mg／L總多糖），及提取物高、中、低劑量組 （分別用含0.5 mg／L LPS的 DMEM 培養(yǎng)液配制成 50、25、12.5 mg／L）。

2.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 調(diào)整細胞密度為1×106／mL后接種于24孔板，每孔600 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸除舊培養(yǎng)基，根據(jù)細胞分組處理12 h，每組均設(shè)3個復(fù)孔，棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗3次后4%多聚甲醛固定10 min，按照Giemsa試劑盒操作步驟染色，倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)的改變。

2.2.5 細胞上清TNF-α、IL-1β水平檢測 采用ELISA法。調(diào)整細胞密度為2×105／mL后接種于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸除舊培養(yǎng)液，按 “2.2.3”項下方法分組 （根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，檢測TNF-α、IL-1β時分別處理6、16 h），取培養(yǎng)上清，離心去除細胞沉淀，按照 ELISA試劑盒操作步驟檢測 TNF-α、IL-1β水平。

2.3 體內(nèi)實驗

2.3.1 分組、造模及給藥 小鼠隨機分為空白組、模型組、肝蘇顆粒組及提取物組，每組12只，除空白組外各組小鼠尾靜脈注射脂多糖 （4 mg／kg）以建立內(nèi)毒素致肝損傷模型，肝蘇顆粒組和提取物組在造模前 12 h、造模后 2 h分別灌胃藥液（1 mg／mL）。

2.3.2 肝臟組織學(xué)檢查 脂多糖注射后12 h，小鼠腹主動脈取血1.5 mL，迅速切取新鮮肝左葉組織2小塊，置于10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

2.3.3 血漿AST、ALT水平檢測 小鼠腹主動脈取血1.5 mL后，4℃、4 000 r／min下離心10 min，吸取上層血清，立即放入EP管中，-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ缓螅凑障鄳?yīng)試劑盒操作步驟檢測ALT、AST水平。

2.3.4 肝組織SOD、MDA水平檢測 取小鼠肝臟同一部位組織，準確稱量約0.5 g，制備肝勻漿液。然后，按照相應(yīng)試劑盒操作步驟檢測SOD、MDA水平。

2.3.5 肝組織ASC、NLRP3表達檢測 采用免疫熒光法。取小鼠肝組織切片，65℃下烘片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，3%H2O2除去內(nèi)源性酶。將切片置于枸櫞酸溶液中高溫修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加0.3%TritonX-100打孔，5%BSA封閉，滴加一抗，4℃下過夜，次日復(fù)溫，滴加熒光二抗，37℃下避光孵育，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察比較并拍照。

3 結(jié)果

3.1 細胞活力 根據(jù) 《美國藥典》中細胞相對增值率與細胞毒性分級的關(guān)系，當水提取物、70%乙醇提取物、95%乙醇提取物質(zhì)量濃度分別在6.25～400、 6.25～100、 6.25～25 mg／L 范圍內(nèi)時細胞毒性分級≤1級，可相應(yīng)在此質(zhì)量濃度及以下進行后續(xù)藥效學(xué)實驗。見圖1。

圖1 提取物對細胞活力的影響Fig.1 Effects of extracts on cell viability

3.2 細胞形態(tài) 未經(jīng)脂多糖刺激的細胞呈圓形，抱團生長，突起較少，邊界清楚；脂多糖刺激后細胞出現(xiàn)抱團現(xiàn)象明顯減少，偽足增加、胞體膨大、細胞邊緣不清、形態(tài)不規(guī)則等活化現(xiàn)象；與模型組比較，70%乙醇提取物組 （25、50 mg／L）細胞偽足明顯減少，胞體體積減小，細胞邊緣較清楚，形態(tài)大體呈圓形，但仍未達到脂多糖刺激前狀態(tài)。見圖2。3.3 細胞上清TNF-α、IL-1β水平 與空白組比較，模型組 TNF-α、IL-1β水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，水提取物組、70%乙醇提取物兩者水平降低，以后者更顯著 （P＜0.05，P＜0.01）。 見圖 3。

圖2 提取物對細胞形態(tài)的影響 （Giemsa，×400）Fig.2 Effects of extracts on cell morphology （Giemsa， ×400）

圖3 提取物對TNF-α （a）、IL-1β （b） 水平的影響Fig.3 Effects of extracts on TNF-α （a） and IL-1β （b） levels

3.4 小鼠肝組織病理學(xué)變化 空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見變性和壞死；模型組小鼠肝小葉匯管區(qū)內(nèi)大量炎細胞浸潤，中性粒細胞增多，肝細胞點狀壞死及小灶性壞死，有的呈氣球樣變化，肝細胞間質(zhì)見大量充血；與模型組比較，肝蘇顆粒組和70%乙醇提取物組炎細胞浸潤和中性粒細胞數(shù)量明顯減少，肝細胞輕度濁腫，未見肝細胞點狀壞死。見圖4。

圖4 小鼠肝組織病理學(xué)變化Fig.4 Pathological changes of mouse liver tissue

3.5 血漿AST、ALT水平 與空白組比較，模型組ALT、AST水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，70%乙醇提取物組兩者水平顯著降低 （P＜0.05）。 見表 1。

表1 提取物對ALT、AST水平的影響 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

表1 提取物對ALT、AST水平的影響 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

注：空白組、95%乙醇提取物組各有2只小鼠死亡，模型組、水提取物組、70%乙醇提取物組各有1只小鼠死亡。與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 脂多糖／（mg·kg-1） 動物數(shù)／只 AST／（U·L-1） ALT／（U·L-1）空白組 — 10 62.76±6.94 36.15±6.41模型組 4 11 214.10±26.84?? 221.09±29.30??肝蘇顆粒組 4 12 100.24±21.45?# 99.87±30.54?#水提取物組 4 11 193.82±14.05?? 98.65±21.58??#70%乙醇提取物組 4 11 144.37±14.01?# 74.46±12.17#95%乙醇提取物組 4 10 217.97±7.81?? 145.98±24.2??

3.6 肝組織SOD、MDA水平 與空白組比較，模型組MDA水平顯著上升 （P＜0.05）；與模型組比較，70%乙醇提取物組MDA水平顯著降低 （P＜0.05），同時各組 SOD水平均無顯著變化 （P＞0.05）。 見表 2。

3.7 肝組織ASC、NLRP3表達 空白組小鼠肝臟中ASC、NLRP3幾乎無陽性表達；模型組小鼠肝臟中兩者表達明顯增強，而且具有共定位性；肝蘇顆粒組和70%乙醇提取物組能明顯降低兩者表達。見圖5。

表2 提取物對SOD、MDA水平的影響 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

表2 提取物對SOD、MDA水平的影響 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

注：空白組、水提取物組各有2只小鼠死亡，模型組、70%乙醇提取物組各有1只小鼠死亡。與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 脂多糖／（mg·kg-1） 動物數(shù)／只 SOD／[U·（mg prot）-1］ MDA／[nmol·（mg prot）-1］空白組 — 10 135.37±12.09 3.16±0.69模型組 4 11 119.49±19.93 5.48±1.37?肝蘇顆粒組 4 12 132.60±13.5 3.79±0.87#水提取物組 4 10 147.57±20.64 4.85±1.26??70%乙醇提取物組 4 11 137.77±23.6 3.99±0.95#95% 乙醇提取物組 4 12 133.34±22.34 5.48±0.53??

圖5 各組ASC、NLRP3表達Fig.5 ASC and NLRP3 expressions in various groups

4 討論

趕黃草在苗族民間用于治療肝病，據(jù) 《中藥大辭典》[8］和 《四川中藥志》[9］記載， 其具有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、退黃、平肝的功效。本實驗發(fā)現(xiàn)，趕黃草70%乙醇提取物可明顯降低脂多糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平，改善肝臟組織病理變化，提示它可減輕肝細胞損傷，改善肝臟功能。

內(nèi)毒素性肝損傷的原理是單核細胞或巨噬細胞在外界刺激作用下向肝臟積聚并致敏，致敏的巨噬細胞接觸到脂多糖后會釋放一些炎性介質(zhì) （如自由基、IL-1β和TNF-α等），繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并造成肝細胞損傷[10］。在內(nèi)毒素性肝損傷中，TNF-α是最關(guān)鍵的細胞因子之一，可與肝星形細胞緊密結(jié)合，釋放多種炎性介質(zhì)，形成瀑布效應(yīng)，也可吸引中性粒細胞進入肝內(nèi)，并產(chǎn)生蛋白酶及超氧陰離子，多種炎性介質(zhì)共同構(gòu)成炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，促進炎癥反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)，引起肝臟壞死性損傷[11-12］。IL-1β細胞活性依賴于釋放細胞因子水平，當其水平較低時，主要生物學(xué)效應(yīng)是引起組織局部炎癥反應(yīng)，同時也可特異性作用于血管內(nèi)皮細胞和單核巨噬細胞，進一步促進IL-6合成[13］；但當IL-1β大量產(chǎn)生時，它可進入血流并引發(fā)機體發(fā)熱效應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)，趕黃草70%乙醇提取物可顯著降低 RAW264.7細胞上清 TNF-α、IL-1β水平，可能是趕黃草保護內(nèi)毒素性肝損傷的重要因素之一。

當機體發(fā)生內(nèi)毒素血癥時，脂多糖誘導(dǎo)固有免疫細胞激活，也是加重肝細胞損傷的重要因素[14］。NLRP3炎性復(fù)合體是固有免疫的重要組成部分，主要存在于細胞內(nèi)，是目前研究最廣泛的NLR家族成員[15］，其小體活化的共同上游機制包括細胞內(nèi)K+外流、溶酶體破裂、活性氧 （ROS） 產(chǎn)生[16］。脂質(zhì)損傷的發(fā)生常伴隨著 ROS生成，而MDA是反應(yīng)膜脂過氧化損傷的重要指標之一[11］，故脂多糖致肝損傷中膜脂過氧化損傷引起ROS釋放增加是激活NLRP3的主要途徑之一。NLRP3是一種復(fù)合體支架，當內(nèi)外源性刺激因素作用于其受體時，它將進行低聚化，進而招募pro-caspase-1和ASC形成NLRP3炎性小體，后者進一步激活Caspase-1，活化后的Caspase-1對前體IL-1β進行剪切，促進后者成熟和分泌[17］，故對NLRP3炎性小體的調(diào)控也是治療LPS性肝損傷的一個重要手段。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織MDA水平明顯增加，表明肝細胞膜脂過氧化損傷嚴重，病理切片顯示大量炎性細胞浸潤，肝細胞壞死；趕黃草70%乙醇提取物可顯著改善上述現(xiàn)象，同時免疫熒光顯示它可明顯降低脂多糖致肝組織ASC、NLRP3表達。因此，趕黃草70%乙醇提取物對小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的保護作用可能與減少TNF-α產(chǎn)生、調(diào)控ROS／NLRP3／IL-1β通路有關(guān)，具體機制還有待進一步確認。