基于光學手段建立一種快速檢測驢皮的方法

史兆松， 劉 麗， 張 淹?， 周祥山， 李士棟， 李廣華， 孔令梅

（1.東阿阿膠股份有限公司國家膠類中藥工程技術研究中心，山東聊城 252201；2.聊城市藥品檢驗所，山東 聊城 252201）

驢皮為馬科馬屬動物驢的皮，是制造傳統膠類中藥阿膠的唯一原料，所制的阿膠產品具有補血滋陰、潤燥止血等功效[1］，為臨床常用補益類中藥。近年來隨著以中醫藥膏方為核心的滋補類市場的形成和昌盛，以阿膠為代表的補益類中藥的需求量逐年增加，逐漸呈現出供不應求之勢[2-3］。而市場調查結果顯示，在我國毛驢養殖業發展比較滯后，驢的存欄量逐年下降與需求量急劇上升的矛盾日益凸顯[4］，連鎖式的影響阿膠原料驢皮逐漸緊缺和價格急劇攀升，導致一些不法廠家在利益的驅動下將馬皮、牛皮等混入驢皮中作為阿膠的原料[5］。在原料性狀鑒別中，由于是驢和馬為同科同屬動物，馬皮與驢皮在毛色、性狀和大小等特征方面十分接近，肉眼較難區分。在傳統醫學中，中醫認為馬皮具有行血作用，而阿膠為補血類藥物，若在阿膠制備過程中摻入馬皮，則會起到相反作用，故控制好驢皮的質量對于阿膠及其制品的質量控制相當關鍵[6］。

目前驢皮藥材標準仍未載入 《中國藥典》，在2002版《山東省中藥材標準》地方標準中，雖將驢皮DNA檢驗方法納入驢皮的補充檢驗方法，但檢驗操作需要進行DNA提取、PCR擴增和DNA序列測定等，同樣文獻報道的核磁共振 （NMR）代謝組學技術及其他現代檢測方法[7-9］，在樣品處理過程中仍需繁瑣的操作步驟，因操作方法的復雜性、樣品數量的龐大性制約了其產業化應用，因此急需建立一種快速簡便、客觀穩定鑒別驢皮的方法。

由于不同種的動物毛纖維具有獨特的裹面形態特征，在內部微觀結構上存在著明顯的差別，這種微觀結構主要取決于動物的先天遺傳差異，具有物種的特異性，并表現出比較復雜的動物生態學特征，動物毛表面鱗片的微觀形態結構及其縱斷面或橫斷面特征可作為物種認定和種屬鑒定的依據[10-12］。因此，建立一種基于光學手段的驢皮顯微鑒別方法，對驢皮及其偽品進行正確判定及凈化產業的發展具有十分重要意義。

1 儀器與試藥

BK5000型生物顯微鏡 （重慶奧特光學儀器有限公司）；Y172型哈氏切片器 （上海精密儀器儀表有限公司）；載玻片、蓋玻片、單刀片、鑷子；火棉膠、甘油、乙醚或石油醚。不同產地 （山東德州、甘肅慶陽、河南沁陽、陜西佳縣等）驢皮；牛皮和馬皮 （牛皮、馬皮購自甘肅張家川供應商），經國家膠類中藥工程技術研究中心鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 采樣方法

2.1.1 縱壓片采樣 用鑷子從待測動物皮的體側部位隨機采集3～4根試驗用動物毛，在石油醚 （30～60℃）中洗去表面的雜質和油脂后，以備觀察。

2.1.2 橫切片采樣 用剪刀從待測動物皮的體側部位隨機采集一定量 （大于500根）的試驗用動物毛，將所取毛樣的毛尖朝同一方向整理成束，用鑷子夾緊在石油醚中清洗干凈后，以備觀察。

2.2 制片方法[13］

2.2.1 縱壓片制片 將采樣處理干凈后的待測動物毛放在載玻片上，調整位置放平，滴甘油1～2滴，蓋上蓋玻片壓平，以備觀察。

2.2.2 橫切片制片 將處理干凈后的待測動物毛整理成束，平鋪在載玻片上排成一列，刷上火棉膠，待火棉膠晾干后將毛束夾入纖維切片器 （Y172型）中夾結實，將兩邊切去后，還原纖維切片器彈簧裝置，并旋轉精密螺絲，使毛束露出其金屬表面約0.1 mm，在露出的毛束表面再涂上一層火棉膠，待晾干后，用鋒利的單刃刀片沿金屬面切下，切樣時刀片與哈氏切片器間的夾角要小，并保持角度不變，使切片厚薄均勻，將其放在滴有甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片即可。

2.3 顯微觀察 把待觀察切片放到顯微鏡下，選用不同的視野進行觀察，找到最具有代表性的視野范圍并進行照相，從照片中挑選清晰的進行對比分析研究。文獻報道用普通生物顯微鏡進行觀察，其縱向觀察放大到100～200倍即可，橫截面需放大到500倍[14］。而本實驗對縱向觀察和橫截面觀察均放大到400倍。

2.3.1 表面觀察 通過顯微鏡觀察發現，不同產地驢毛表面均比較粗糙，鱗片分布不清晰，鱗片的翹角較大且光澤好，多呈刺狀、塊片狀或芽孢狀伸向毛干外側，分布不均勻；馬毛表面比較光滑，鱗片呈波紋狀或瓦楞形密布在表面，鱗片的間隙比較大，表面較少有鱗片翹角，多呈沙粒狀分布于毛干上，分布不均；牛毛表面比較粗糙，鱗片呈波紋狀或瓦楞形層疊密布于表面，鱗片間隙比較小，表面未有鱗片翹角，見圖1。

圖1 不同動物毛表面顯微鏡觀察

2.3.2 切面觀察 通過顯微鏡對不同動物毛橫切面進行顯微鏡觀察，不同產地驢毛橫切面均有有明顯的髓，且髓質層比較發達，髓質層與皮質層清晰可見，髓腔較大、呈類圓形或長橢圓形；馬毛橫切面也有明顯的髓，且髓質層與皮質層清晰可見，皮質層較厚，髓腔較小、呈似圓形或橢圓形；牛毛橫切面無髓，見圖2。

通過顯微鏡對不同動物毛縱切面進行顯微鏡觀察，結果顯示不同動物毛縱切面無明顯的差異特征，見圖3。

2.4 觀察結果 通過顯微觀察法中的表面觀察法和橫切面觀察法，可有效的區分在毛色、性狀和大小等方面十分接近的特征。為進一步驗證該方法的準確性，采用盲樣測定法進行測定，結果可全部準確判斷。

3 討論與結論

圖2 不同產地動物毛橫切面顯微鏡觀察

圖3 不同動物毛縱切面顯微鏡觀察

顯微觀察法在毛皮種類的鑒別方面多用于毛皮產業服裝原料皮的鑒別[15］， 特別在裘皮、貂皮等珍貴皮料鑒別中應用較廣泛，同時觀察動物毛顯微結構方法也較多，如掃描電鏡觀察首先將毛分別用電膠粘于掃描電鏡的樣品臺上，再用離子濺射儀鍍金鈀合金后，然后在加速電壓掃描電鏡下進行觀察拍照[16］，這種方法得到的圖片清晰，但成本比較高；手搖切片機切片法，須先將待測的毛樣進行處理后，再經石蠟包埋后才可進行切取[17］，雖可得到較薄且均勻的切片，但檢測周期較長。同樣對于驢皮的檢驗方法，如DNA鑒別、核磁共振代謝組學技術等，在樣品處理和測定過程中，需要繁瑣的操作步驟和較長的檢測周期。

關于阿膠原料驢皮的鑒別，對于夾雜的豬皮、羊皮等，在色澤、形態和張幅上存在很明顯的差異，僅靠視角觀察即可剔除；對于馬皮、牛皮等大張幅皮，由于在毛色、形狀和大小等特征方面十分接近，肉眼較難區分。課題組借鑒毛皮產業服裝原料皮的檢測方法，建立了一種快速、準確、穩定的檢測方法，為驢皮檢測標準提供了新的思路。