辣木種子提取物對小鼠實驗性肝損傷的保護作用

梁華峰， 張莉莉， 吳 帥， 朱正蘭， 葉文才， 李滿妹

（暨南大學藥學院，廣東廣州 510632）

辣木Moringa oleifera Lam.為辣木科辣木屬落葉喬木，又名油辣木、辣根樹、鼓槌樹等，原產于印度，現廣泛分布于非洲、阿拉伯、東南亞等熱帶海洋氣候區，我國廣東韶關、云南、海南、貴州等地現有引種[1］。辣木是非洲和東南亞地區一種歷史悠久的傳統藥物，其藥效價值和營養價值在當地被廣泛認可，辣木籽在民間常被用于醒酒和排毒，具有抗炎、抗菌、降血壓、降血脂、調節血糖、抗腫瘤以及抗氧化等功能[2］；辣木樹葉或種子提取物可保護大鼠的肝損傷[3-5］，但相關研究很少涉及其作用機理。因此，本實驗建立小鼠急性酒精性肝損傷、小鼠四氯化碳致急性肝損傷模型，研究辣木種子提取物對小鼠肝臟的保護作用及機制，為治療急性肝損傷提供依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性昆明小鼠，體質量20～22 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK（粵）2008-0002。小鼠飼養于25℃恒溫動物房中，每天明暗交替12 h（7：00～19：00）；自由飲水和飲食，適應性飼養7 d后進行實驗。

1.2 試藥 辣木種子提取物由本課題組制備，方法為辣木種子粉碎后按1∶10比例加水回流提取3次，每次 2 h，過濾后濃縮，即得。Pierce BCA protein assay kit購自美國Thermo公司；甘草酸苷片購自日本米諾發源制藥株式會社 （批號15089）；乳酸脫氫酶 （LDH）、丙二醛 （MDA）、谷丙轉氨酶 （ALT）、谷草轉氨酶 （AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總超氧化物歧化酶 （T-SOD）、谷胱甘肽還原酶 （GR）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）、谷胱甘肽 （GSH）、HE染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗乙醇脫氫酶 1A／1B／1C（ADH1A／1B／1C） 抗體、 兔抗乙醛脫氫酶 2（ALDH2）抗體均購自美國Epitomics公司；小鼠抗β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根標記山羊抗兔IgG、辣根標記兔抗小鼠IgG均購自美國Proteintech Group公司。

1.3 儀器 MK3型酶標儀購自美國Thermo公司；IX51型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；RM2235型切片機購自德國Leica公司；凝膠成像分析系統、PCR儀購自美國Bio-Rad公司；BS210S型電子分析天平購自德國Sartorius公司；3-18 K型臺式高速冷凍離心機、2-5型離心機購自美國Sigma公司；ULTRA-TURRAX T8型組織勻漿機購自德國IKA Labortechnik公司。

2 方法

2.1 辣木種子提取物對小鼠肝組織ADH1和ALDH2 mRNA、蛋白表達的影響

2.1.1 分組及給藥 24只小鼠隨機分為對照組和辣木種子提取物組，每組12只，對照組灌胃10 mL／kg生理鹽水，辣木種子提取物組灌胃500 mg／kg的提取物溶液 （10 mL／kg）， 每天 1次，共7 d。最后1次灌胃后0.5 h，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟，提取mRNA，于-80℃冰箱中保存。

2.1.2 mRNA表達檢測 Trizol提取肝組織勻漿中總RNA，紫外分光光度測定260、280 nm波長處的吸光度，計算OD260nm／OD280nm，總 RNA濃度＝OD260nm×稀釋倍數×0.040。采用RT-PCR法進行逆轉錄構建cDNA模板，逆轉錄反應條件參照試劑盒說明，通過NCBI網頁找到所需基因序列，利用Primer premier 6.0設計特異性引物：ADH1正向5′-TTTTGTAGCCGAAGCGATCTG-3′， 反 向 5′-TACCACGGTGTACTGGGAGAA-3′， PCR 產物長度129 bp； ALDH2 正 向 5′-GACGCCGTCAGCAGG AAAA-3′， 反向 5′-CGCCAATCGGTACAACAGC-3′，PCR產物長度 189 bp；GAPDH正向 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′， 反向 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′， PCR 產物長度123 bp。

然后，通過PCR儀進行擴增，反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，共45個循環；熔解曲線條件為95℃ 5 s，65℃ 1 min，0.11℃／s升溫至97℃，每升溫5℃檢測1次熒光，最后降溫至50℃。

2.1.3 蛋白表達檢測 肝臟加入RIPA裂解液進行裂解、提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用Western blotting法[6］進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶溶液室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，在搖床上用TBST洗滌3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST再洗滌3次，通過ECL發光液檢測ADH1、ALDH2蛋白表達，并根據灰度值計算兩者蛋白表達相對量。

2.2 辣木種子提取物對急性酒精性肝損傷小鼠的作用

2.2.1 建模、分組及給藥 60只小鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組、模型組、甘草酸苷組及提取物低、中、高劑量組，每組10只，對照組、模型組小鼠灌胃生理鹽水，甘草酸苷組灌胃85 mg／kg甘草酸苷，提取物低、中、高劑量組分別灌胃125、250、 500 mg／kg 提取物， 給藥量均為10 mL／kg，連續10 d，末次灌胃前12 h禁食不禁水。第10天灌胃30 min后，除對照組外各組小鼠灌胃18 mL／kg 50%乙醇。

2.2.2 取樣及檢測 50%乙醇灌胃8 h后乙醚麻醉小鼠，心臟采血至肝素抗凝管中，4℃、3 000 r／min下離心 15 min取血漿，測定 ALT、AST、ALP、LDH水平；肝組織在生理鹽水中高速勻漿30 s，制備10%生理鹽水肝勻漿液，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液于新EP管中，作為肝組織勻漿液，根據相應試劑盒操作步驟測定GSH、MDA水平。

2.3 辣木種子提取物對四氯化碳致急性肝損傷小鼠的作用

2.3.1 建模、分組及給藥 60只小鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組、模型組、甘草酸苷組及提取物低、中、高劑量組，每組10只，對照組、模型組小鼠灌胃生理鹽水，甘草酸苷組灌胃85 mg／kg甘草酸苷，提取物低、中、高劑量組分別灌胃32.5、75、150 mg／kg提取物，連續15 d，末次灌胃前12 h禁食不禁水。第15天灌胃30 min后，對照組小鼠腹腔注射10 mL／kg橄欖油，其他各組小鼠腹腔注射10 mL／kg四氯化碳橄欖油溶液 （16 mg／kg）。

2.3.2 取樣及檢測 各組小鼠腹腔注射CCl4橄欖油溶液18 h后乙醚麻醉，心臟采血至肝素抗凝管中，4℃、3 000 r／min離心15 min取血漿，測定ALT、AST水平。同時取肝組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，制成石蠟切片用于病理學檢查；另一部分按 “2.2.2”項下方法勻漿，根據相應試劑盒操作步驟測定MDA、GSH、T-SOD、GR、GSH-Px水平。

再采用 RT-PCR 法檢測 C／EBPα、 TNF-α、SREBP-1c、COX-2 mRNA表達，操作方法同“2.1.2” 項。 C／EBPα 正 向 5′-TTACAACAGGCCAGGTTTCC-3′， 反 向 5′-GGCTGGCGACATACAGTACA-3′， PCR 產物長度 187 bp； TNF-α 正向 5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3′， 反 向 5′-TACA GGCTTGTCACTCGAATT-3′， PCR產物長度110 bp；SREBP-1c 正 向 5′-TGTTGGCATCCTGCTATCTG-3′，反向 5′-AGGGAAAGCTTTGGGGTCTA-3′， PCR 產物長度 189 bp； COX-2正向 5′-GCACTTCACCCATCAGTT-3′， 反 向 5′-AGTTGCTCATCACCCCAC-3′，PCR產物長度 375 bp；GAPDH正向 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′， 反向 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′， PCR 產物長度123 bp。

然后，通過PCR儀進行擴增，反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s（C／EBPα退火溫度51℃，30個循環；TNF-α退火溫度50℃，40個循環；SREBP-1c退火溫度51℃，28個循環；COX-2退火溫度60℃，30個循環；GAPDH退火溫度60℃，30個循環），72℃先延伸30 s再延伸7 min使產物延伸完全。反應結束后，取10 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統拍照。

2.4 統計學分析 RT-PCR數據通過LightCycler 480軟件進行處理，用target／reference比值表示；Western blotting數據通過Quantity one軟件進行灰度分析。所有數據均采用Student’s t-test進行統計學分析，用 （） 表示。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 提取物對ADH1和ALDH2 mRNA、蛋白表達的影響 圖1顯示，與對照組比較，提取物組ADH1 mRNA、蛋白表達顯著升高 （P＜0.05），但對ALDH2無顯著影響 （P＞0.05）。

圖1 提取物對ADH1和ALDH2 mRNA、蛋白表達的影響Fig.1 Effects of extract on the mRNA，protein expressions of ADH1 and ALDH2

3.2 提取物對急性酒精性肝損傷小鼠血漿ALT、AST、LDH、ALP水平的影響 表1顯示，與對照組比較，模型組ALT、AST、LDH、ALP水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，提取物組 ALT、AST、ALP水平顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），并且中、高劑量組LDH水平也顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

表1 提取物對ALT、AST、LDH、ALP、GSH、MDA水平的影響s， n＝8）Tab.1 Effects of extract on ALT，AST，LDH，ALP，GSH and MDA levelss， n＝8）

表1 提取物對ALT、AST、LDH、ALP、GSH、MDA水平的影響s， n＝8）Tab.1 Effects of extract on ALT，AST，LDH，ALP，GSH and MDA levelss， n＝8）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）ALT／（IU·L-1）AST／（IU·L-1）LDH／[nmol·（ min·mg） -1 ］ALP／（IU·L-1）GSH／（μg·mg-1）MDA／（ nmol·mg-1 ）對照組 — 46.26±6.18 53.78±6.70 3 373.29±324.82 6.06±0.39 2.23±0.19 2.89±0.82模型組 — 66.42±10.79## 79.50±10.39## 4 512.42±387.29## 8.95±0.93## 1.93±0.10## 7.83±1.84##甘草酸苷組 85 46.81±9.73? 51.30±8.09?? 3 494.82±325.72?? 7.12±0.61?? 2.10±0.10?? 4.05±1.41??提取物低劑量組 125 52.74±4.87?? 66.02±11.25? 4 029.13±368.99 7.02±0.77?? 2.19±0.25? 7.39±1.80提取物中劑量組 250 49.51±7.43?? 60.36±5.57?? 3 807.45±378.93? 6.97±0.73?? 2.25±0.24?? 5.57±0.99??提取物高劑量組 500 44.53±6.92?? 55.60±6.88?? 3 733.54±385.83?? 6.69±0.42?? 2.38±0.21?? 4.50±1.10??

3.3 提取物對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織GSH、MDA水平的影響 表1顯示，與對照組比較，模型組GSH水平顯著降低 （P＜0.01），MDA水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，提取物組GSH水平顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01），并且中、高劑量組MDA水平顯著降低 （P＜0.01）。

3.4 提取物對四氯化碳致急性肝損傷小鼠血漿ALT、AST水平的影響 表2顯示，與對照組比較，模型組ALT、AST水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，提取物組兩者水平顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

表2 提取物對ALT、AST、T-SOD、MDA、GSH、GR、GSH-Px水平的影響 ±s， n＝8）Tab.2 Effects of extract on ALT，AST，T-SOD，MDA，GSH，GR and GSH-Px levels±s， n＝8）

表2 提取物對ALT、AST、T-SOD、MDA、GSH、GR、GSH-Px水平的影響 ±s， n＝8）Tab.2 Effects of extract on ALT，AST，T-SOD，MDA，GSH，GR and GSH-Px levels±s， n＝8）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）ALT／（IU·L-1）AST／（IU·L-1）T-SOD／（U·mg-1）MDA／（ nmol·mg-1 ）GSH／（μg·mg-1）GR／（U·mg-1）GSH-Px／（U·mg-1）對照組 - 32.62±6.55 36.02±3.87 285.79±16.59 1.88±0.48 1.50±0.21 1.17±0.22 36.02±3.87模型組 - 10 782±1 254## 7 264±897## 230.14±8.09## 5.81±1.01##1.01±0.15##0.56±0.11## 72.64±8.97##甘草酸苷組 85 4 598±876?? 4 459±477?? 260.13±24.00?? 3.32±0.53?? 1.23±0.23?? 0.87±0.18?? 44.59±4.77??提取物低劑量組 32.5 9 383±1 249? 7 326±671?? 248.98±14.26?? 4.62±1.07? 1.14±0.09 0.63±0.14 63.26±6.71??提取物中劑量組 75 9 157±1 479? 5 941±693?? 257.25±13.16?? 3.97±0.66?? 1.20±0.28 0.71±0.07?? 59.41±6.93??提取物高劑量組 150 7 882±842?? 5 383±360?? 258.99±15.22?? 3.62±0.57?? 1.35±0.16?? 0.83±0.17?? 53.83±3.60??

3.5 提取物對四氯化碳致急性肝損傷小鼠肝組織TSOD、MDA、GSH、GR、GSH-Px水平的影響 表2顯示，與對照組比較，模型組T-SOD、GSH、GR水平顯著降低 （P＜0.01），MDA、GSH-Px水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，提取物組TSOD水平顯著提高 （P＜0.01），MDA、GSH-Px水平顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），并且高劑量組GSH水平顯著升高 （P＜0.01），中、高劑量組GR水平顯著升高 （P＜0.01）。

3.6 提取物對四氯化碳致急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響 圖2顯示，對照組小鼠肝細胞排列整齊、大小均一，細胞核呈圓形，界限清晰，分布在肝細胞中央，肝小葉結構正常；模型組小鼠肝細胞排列紊亂，細胞質疏松、腫脹，嗜酸性下降（嗜酸性細胞質容易和酸性染料伊紅結合，染成粉紅色），細胞核固縮，形態不一，小靜脈周圍可見大量點狀或片狀壞死，肝細胞索排列紊亂，肝小葉界限不清，肝細胞內呈現明顯空泡狀；提取物低劑量組小鼠肝細胞壞死有所減少，肝細胞排列較模型組稍緊密，細胞內空泡減少；提取物高劑量組小鼠肝細胞排列整齊、致密，肝細胞內無明顯的空泡和疏松，肝小葉結構基本完整，結構清晰，肝細胞索排列整齊。

3.7 提取物對四氯化碳致急性肝損傷小鼠肝組織C／EBPα、 TNF-α、 SREBP-1c、 COX-2 mRNA 表達的影響 圖3顯示，與對照組比較，模型組C／EBPα、COX-2 mRNA 表達顯著降低 （P＜0.01）， TNF-α、SREBP-1c mRNA表達顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，提取物組C／EBPα mRNA表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）， SREBP-1c、 COX-2 mRNA 表達顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），并且中劑量組TNF-α mRNA表達顯著降低 （P＜0.05）。

圖2 提取物對肝組織病理學的影響 （HE染色）Fig.2 Effects of extract on liver histopathology （HE staining）

4 討論

為了考察辣木種子提取物降低血液中乙醇體積分數的方式，本實驗檢測了與酒精代謝有關的乙醇脫氫酶 1（ADH1）和乙醛脫氫酶 2（ALDH2）mRNA、蛋白表達，發現連續 7 d給予小鼠500 mg／kg提取物后，ADH1 mRNA、蛋白表達均顯著增加，但對ALDH2影響不明顯。由此可知，辣木種子提取物能通過提高ADH1表達加速乙醇在肝臟的代謝，從而降低血液中乙醇體積分數。

研究顯示，酒精性肝損傷與超氧離子和自由基大量生成有關[7-8］，兩者可攻擊生物膜引起脂質過氧化，造成細胞膜和線粒體膜等功能障礙，從而導致細胞損傷或死亡，這個過程伴隨轉氨酶釋放、脂質過氧化產物生成、抗氧化相關酶 （SOD、GR、GSH-Px）活性改變、抗氧化物質GSH水平變化等。本實驗發現，辣木種子提取物能夠不同程度降低急性酒精性肝損傷小鼠血漿轉氨酶水平，緩解了ALP、LDH水平升高，呈現出對肝臟的保護作用；升高肝組織GSH水平，表明提取物能提高肝臟抗氧化水平，而肝組織MDA水平的降低提示脂質過氧化水平的降低。總的來說，辣木種子提取物可能通過加強小鼠肝臟的抗氧化平衡體系來減少酒精對肝臟的損傷。

由于四氯化碳肝損傷模型中肝臟病理學改變與人的肝臟疾病具有很高的相似性，故四氯化碳常用來復制人的肝病模型[9］。血液中轉氨酶水平是衡量肝損傷的重要指標，其升高是CCl4肝損傷的重要表現，其中丙二醛 （MDA）水平反映機體脂質過氧化程度[10］；總超氧化物歧化酶 （T-SOD）活力間接反映機體清除自由基能力[11］；谷胱甘肽還原酶 （GR）能催化氧化谷胱甘肽 （GSSH）還原成還原型谷胱甘肽 （GSH），其主要作用是清除自由基，防止脂質過氧化反應發生，其水平也是衡量機體抗氧化能力的重要因素；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性反映GSH抗氧化能力變化。

本實驗發現，四氯化碳可使血漿ALT、AST水平顯著升高，而辣木種子提取物可不同程度地緩解。同時，提取物能顯著降低肝組織MDA水平，緩解四氯化碳致T-SOD活力下降，在抗脂質氧化、維持肝組織抗氧化水平方面具有一定作用；緩解GSH水平下降，增強肝組織GR活力，使GSH合成量增加、水平升高，可能與增強GR的活力和提高機體抗氧化能力有關；逆轉四氯化碳致小鼠肝臟GSH-Px代償性升高，減少因對抗自由基損傷而造成的GSH的損耗，提高GSH水平；明顯改善四氯化碳對小鼠肝組織的病理損傷，可能與緩解炎癥反應發生有關。

肝星狀細胞 （HSC）的激活在肝臟疾病，如肝纖維化和肝硬化中發揮著主要作用，通過在活化的HSC中過表達C／EBPα可抑制HSC增殖，表明上調C／EBPα表達可以抑制HSC[12］。本實驗發現，辣木種子提取物可明顯上調C／EBPα mRNA表達，表明它對對小鼠肝損傷的保護作用可能與通過上調C／EBPα mRNA表達、抑制HSC激活有關。同時，C／EBPα還是COX-2的關鍵調節因子，高表達的COX-2能激活COX-前列腺素通路，造成細胞炎癥和壞死；本實驗發現辣木種子提取物可使COX-2 mRNA表達顯著下降，可能與其參與C／EBPα調控有關。由此推測，辣木種子提取物抗炎作用可能與上調C／EBPα mRNA表達、抑制HSC激活、降低COX-2 mRNA表達有關。

圖3 提取物對 C／EBPα （A）、 TNF-α （B）、 SREBP-1c（C）、COX-2（D）mRNA表達的影響Fig.3 Effects of extract on C／EBPα （A）， TNF-α （B），SREBP-1c（C） and COX-2（D） mRNA expressions

在正常情況下，機體內TNF-α活性極低，而在病理條件下它會大量表達，對機體造成損傷。本實驗發現，四氯化碳造成了小鼠肝臟TNF-α mRNA表達明顯提高，表明四氯化碳通過刺激Kupffer細胞大量表達TNF-α來損害肝細胞，而辣木種子提取物能降低其表達。由此可知，辣木種子提取物還可能通過抑制CCl4對Kupffer細胞激活、降低TNF-α表達來發揮肝臟保護作用。

SREBP-1c與肝臟脂肪變性密切相關，其過表達會造成脂肪酸合成酶 mRNA水平增加4倍；SREBP-1基因敲除小鼠血清甘油三酯水平顯著降低，而其基因過表達時小鼠則表現出肝臟脂肪堆積、膽固醇合成相關基因的大量表達[13］。本實驗發現，四氯化碳促進了小鼠肝臟SREBP-1c mRNA表達，而辣木種子提取物可下調其表達，推測它可能通過抑制肝損傷時SREBP-1c激活來抑制脂肪酸和膽固醇合成，從而減輕脂質代謝紊亂給肝臟帶來的損傷。

綜上所述，辣木種子提取物對小鼠實驗性肝損傷 （急性酒精性肝損傷、四氯化碳致急性肝損傷）有明顯保護作用，其機制可能涉及如下幾個方面：（1）辣木種子提取物通過提高ADH1蛋白表達，從而加快乙醇的代謝； （2）辣木種子提取物通過上調C／EBPα mRNA表達，從而調控并抑制COX-2 mRNA表達，減緩炎癥反應發生； （3）辣木種子提取物部分降低前炎癥因子TNF-α mRNA表達，從而抑制炎癥反應的發生； （4）辣木種子提取物通過下調SREBP-1c mRNA表達，從而抑制脂肪酸和膽固醇合成，減輕脂質代謝紊亂給肝臟帶來的傷害。由此可知，日常服用辣木種子可預防和改善酒精或其他化學物質對肝臟造成的損傷。