鼻腔定植耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離及其對(duì)消毒劑抗性研究

□李旺勝 于凡凡 肖 娜 唐一通

一、材料與方法

(一)菌株來源。試驗(yàn)菌株為收集自108例健康在校大學(xué)生鼻拭紙樣本(男生65例，女生43例)，所有樣本均為來自不同個(gè)體的非重復(fù)性樣本。

(二)實(shí)驗(yàn)材料。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarTM法國(guó)科瑪嘉)，哥倫比亞血瓊脂平板，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒，即用Taq PCR擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。試驗(yàn)所用碘伏消毒劑(有效碘0.5%)和75%乙醇購(gòu)自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

(三)試驗(yàn)方法。

1.菌株顯色培養(yǎng)與MRSA菌株鑒定。將收集鼻拭紙樣本接種至顯色培養(yǎng)基，37℃，恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，挑取紅色或粉紅色菌落保存。并將挑選好的菌落接種至哥倫比亞血瓊脂平板，37℃，恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。提取菌株基因組，進(jìn)行SCCmecA基因PCR擴(kuò)增，鑒定MRSA菌株。PCR引物為：forward:5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’;Reverse:5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’。擴(kuò)增體系為：模板3μl;引物2μl;2×Master mix 10μl; ddH2O 5μl 擴(kuò)增條件為：95℃ 4min；95℃ 45S，45℃ 45S，72℃ 60S；30循環(huán),72℃ 5min。

2.菌懸液制備。分別取3株MRSA和MSSA菌株接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。721型紫外-可見分光光度計(jì)分別進(jìn)行吸光度值(600nm)測(cè)定。用肉湯培養(yǎng)基將各菌株所在菌懸液吸光度值調(diào)整至0.5 OD備用。

3.MIC測(cè)定。肉湯稀釋法[1]，用滅菌蒸餾水對(duì)各消毒劑母液做系列對(duì)倍稀釋，取各稀釋度消毒液2.5ml加入到雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中，分別接種0.1ml菌懸液作為試驗(yàn)組。以同樣方法接種于不含消毒劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯中作陽(yáng)性對(duì)照組；另取3支無菌試管加入滅菌蒸餾水與等量雙倍肉湯混合作陰性對(duì)照組。將各組接種試管，37℃，恒溫培養(yǎng)48小時(shí)觀察結(jié)果。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管混濁(有菌生長(zhǎng))，陰性對(duì)照管澄清(無菌生長(zhǎng))，試驗(yàn)組無菌生長(zhǎng)的最低消毒劑的濃度為MIC值。每個(gè)試驗(yàn)菌株各重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

二、結(jié)果

(一)細(xì)菌分離與鑒定。樣本中細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示：108例鼻拭紙樣本接種至顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，共有44例樣本培養(yǎng)出紅色(粉紅色)菌落，為金黃色葡萄球菌(SAU)所在菌落，SAU檢出率40.7%。提取SAU菌株基因組，經(jīng)SCCmecA基因擴(kuò)增，有8株擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，確定為MRSA菌株，檢出率7.4%。

(二)MIC測(cè)定結(jié)果。兩種消毒劑對(duì)MSSA和MRSA菌株的MIC測(cè)定結(jié)果表明：碘伏消毒劑對(duì)MSSA和MRSA菌株的MIC均為312.5mg/L，乙醇消毒劑對(duì)MSSA和MRSA菌株的MIC均為46,875mg/L，MRSA菌株和MSSA菌株對(duì)兩種消毒劑的最小抑菌濃度沒有明顯差別。

三、討論

消毒是預(yù)防和控制細(xì)菌感染的重要措施。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌家族攜帶的qabA/B基因可增強(qiáng)對(duì)其消毒劑的耐受性[2]。有報(bào)道指出，不同地區(qū)分離株各型的腸毒素基因分布存在差異[3]，對(duì)評(píng)估金黃色葡萄球菌的消毒劑抗性研究有重要意義。縱帥[4]等對(duì)徐州地區(qū)醫(yī)院住院患者送檢病原學(xué)標(biāo)本分離的MRSA耐藥表型和抗消毒劑基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，MRSA菌株中有28.0%攜帶抗消毒劑基因qacA/B,MSSA菌株中攜帶qacA/B基因僅占7.3%。表明MRSA菌株攜帶抗消毒劑基因比例明顯高于MSSA，提示MRSA和MSSA對(duì)消毒劑抗性或存在一定差異。林茹等對(duì)寧夏地區(qū)金黃色葡萄球菌的報(bào)道和沈林海等人的研究也有力地支持這一觀點(diǎn)[5～6]。也有報(bào)道指出，消毒劑對(duì)多種細(xì)菌的抑菌濃度并無明顯差異[7]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌攜帶的耐消毒基因qacA/B通過表達(dá)主動(dòng)外排多重耐藥蛋白，從而介導(dǎo)對(duì)消毒劑抗性增加的現(xiàn)象[8～11]。

在校大學(xué)生作為典型的社區(qū)群體，其攜帶的金黃色葡萄球菌對(duì)常用消毒劑的抗性情況具有代表意義，可以為社區(qū)人群針對(duì)金黃色葡萄球菌的防控工作提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過對(duì)比培養(yǎng)顯示，在校大學(xué)生群體鼻腔具有一定比例MRSA定植率，其攜帶MRSA和MSSA菌株對(duì)常用消毒劑碘伏和酒精的最小抑菌濃度無明顯差異。