噬菌體展示技術篩選人乳腺髓樣癌細胞特異性結合肽

張 帆,賈 昕,姚 紅,逯曉青,郭 超,楊曉峰

(1山西醫科大學微生物學與免疫學教研室,太原 030001;2山西醫科大學第一醫院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:yxfylq@163.com)

乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常見的惡性腫瘤,其病死率居于女性腫瘤之首。我國乳腺癌患者死亡率高于國外患者,但治愈率較低,嚴重威脅著女性的生命健康,近年來乳腺癌靶向藥物顯著提高了患者治療效果[1]。目前迫切需要研發新的診斷和治療手段以提高乳腺癌患者的治愈率和降低死亡率。而尋找無創、敏感性高、特異性強且簡單可行的腫瘤標志物作為乳腺癌的早期診斷和治療工具將具有重要的臨床應用價值。

噬菌體展示技術是一種將多肽或蛋白展示在噬菌體衣殼蛋白表面,并能將所需的多肽或蛋白從含有大量變異體的集落中分離出來的實驗技術。十幾年來,國內外的研究人員利用噬菌體展示技術針對不同的腫瘤進行篩選,發現了多種腫瘤靶向肽,這些靶向肽對腫瘤細胞及其微環境例如腫瘤血管有親和力[2]。這些特異性多肽既可以作為體內腫瘤成像劑,用于腫瘤及其微轉移灶的早期診斷;也可用于連接抗癌藥物進行靶向治療,而不損傷其他健康組織。Bcap-37細胞屬于浸潤性乳腺髓樣癌細胞,通過國內外獻檢索尚未發現利用噬菌體展示技術篩選人Bcap-37細胞靶向肽的研究,本研究利用噬菌體展示技術篩選人乳腺癌細胞特異性結合小肽,為乳腺癌早期診斷的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺髓樣癌Bcap-37細胞、人正常乳腺上皮細胞MCF-10A購自上海奧陸生物科技有限公司。噬菌體展示七肽庫試劑盒(Ph.D.TM-7 Phage Display Peptide Library Kit)購自New English Biolabs(NEB)公司。M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒(M13 Isolation Kit)購自美國Biomiga公司。辣根過氧化物酶標記的抗M13單克隆抗體(HRP/Anti-M13)購自美國GE Healthcare公司。IPTG、Xgal、PEG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 噬菌體展示七肽庫體外減性篩選

將人乳腺髓樣癌Bcap-37細胞及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A培養于DMEM高糖培養基中(含10%胎牛血清),37 ℃、5% CO2培養。將兩種細胞懸液置于經過多聚賴氨酸處理的細胞培養皿中,在人乳腺癌Bcap-37細胞加入1%牛血清白蛋白(BSA)BSA 37 ℃孵育1 h時，加入Ph.D.TM- 7原始噬菌體展示七肽庫原液(滴度為2×1011pfu/ml)，37 ℃孵育1 h，用0.05% TBST洗滌5次去除未與細胞結合的噬菌體，加入0.2 mol/L甘氨酸洗脫液1 ml，將結合噬菌體洗脫下來。將洗脫液加入到已經封閉好的人正常乳腺上皮MCF-10細胞培養皿中,室溫下作用1 h,上清液即為第一輪篩選得到的噬菌體,PEG法提純,進入下一輪篩選。噬菌體展示肽庫體外減性篩選條件,肽庫與人乳腺癌Bcap-37細胞結合時間分別減少到45 min(第2輪)、30 min(第3輪)和20 min(第4輪);洗脫液與人正常乳腺上皮MCF-10A細胞吸附時間增加到75 min(第2輪)、90 min(第3輪)和105 min(第4輪);把第4輪篩選所得的噬菌體液接種LB/IPTG/Xgal瓊脂平板,隨機挑選藍色陽性噬菌體克隆大量擴增提純。

1.3 單克隆噬菌體與Bcap-37細胞結合的特異性鑒定

從LB/IPTG/Xgal瓊脂平板隨機挑取的20個單克隆噬菌體進行特異性檢測,將人乳腺癌Bcap-37細胞及正常乳腺上皮MCF-10A細胞以2×104/孔的密度鋪于96孔板,PBS做空白對照(每組設2個復孔)。PBS沖洗細胞,加入50 μl 0.25%戊二醛溶液固定細胞15 min。加入100 μl 3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶的活性。用5% PBS-BSA 37 ℃封閉60 min。每孔分別加入1×1010pfu單克隆噬菌體，37 ℃孵育1.5 h。PBS沖洗5次，加入HRP/Anti-M13抗體(100 μl/孔)，37 ℃作用1 h，加入TMB顯色液，待液體變藍后,全自動酶標儀檢測450 nm處的OD值。將人乳腺癌Bcap-37細胞OD值設為S、正常乳腺上皮MCF-10細胞OD值設為P,采用公式為:S/P(S及P值均是相應的OD值減去PBS空白對照的OD值之后的值),若比值大于2.5即為陽性結果。

1.4 陽性單克隆噬菌體單鏈DNA測定及分析

將陽性噬菌體克隆用M13噬菌體單鏈DNA提取試劑盒提取核酸，使用噬菌體肽庫試劑盒自帶-96gⅢ測序引物：5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′,由上海英濰捷基貿易有限公司測序。登陸NCBI-BLAST網站對篩選的多肽序列與目前數據庫中已知蛋白質的氨基酸序列進行同源性分析。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞特異性結合噬菌體多肽的富集

以人乳腺髓樣癌Bcap-37細胞為靶細胞,人正常乳腺上皮細胞MCF-10A為吸附細胞,使用噬菌體展示隨機七肽庫,進行4輪減性篩選。結果顯示,噬菌體滴度由第1輪的4.0×104增加到第4輪的3.2×107(見圖1);同時回收得率也由第1輪的2.0×10-7增加至第4輪的1.6×10-4,提高了約800倍(見表1)。表明與人乳腺癌Bcap-37細胞特異性結合的噬菌體逐漸增加,到第4輪出現明顯富集。

A. 第1輪篩選后噬菌體滴度測定 B. 第4輪篩選后噬菌體滴度測定圖1 噬菌體滴度測定Figure 1 Phage titer determination

表1噬菌體展示肽庫體外篩選后噬菌體克隆富集

Table1EnrichmentofphageclonesfromPhageDisplayPeptidesLibrarybyinvitroscreening

篩選輪數投入噬菌體量(pfu)回收噬菌體量(pfu)回收率12×10114.0×1042.0×10-722×10111.8×1069.0×10-632×10111.4×1077.0×10-542×10113.2×1071.6×10-4

回收率=洗脫回收的噬菌體量/投入的噬菌體量

2.2 乳腺癌細胞特異性結合噬菌體克隆的鑒定

隨機挑取20個單克隆噬菌體藍斑,利用ELISA法鑒定單克隆噬菌體對人乳腺癌Bcap-37細胞的親和力。結果顯示,1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20號噬菌體Bcap-37細胞的OD450 nm值顯著高于MCF-10A細胞,S/P比值大于2.5,為陽性噬菌體克隆(見圖2)。

圖2 ELISA檢測單克隆噬菌體親和力Figure 2 The affinity of monoclone phage by ELISA

2.3 乳腺癌細胞陽性噬菌體DNA的測序及同源性分析結果

挑取20個陽性的噬菌體克隆進行DNA提取并測序(見圖3),得到外源性七肽插入的堿基序列,并翻譯出對應的氨基酸序列。結果顯示,重復率最高的噬菌體克隆的多肽序列為LXRNTNX(13/20),其次為SAGFRIX(5/20)及LPPMNSX(2/20);LXRNTNX即為本研究篩選所得的七肽序列。氨基酸序列的同源性分析結果顯示,該序列與數據庫中已知基因和蛋白無同源性,且國內外文獻均未見報道。

圖3 陽性單克隆噬菌體基因測序圖Figure 3 Gene sequencing map of positive monoclonal phage

3 討論

1985年Smith等[3]成功創立了噬菌體展示技術,1990年Scott等[4]在噬菌體展示技術的基礎上發展并構建了噬菌體展示隨機肽庫。通過肽庫技術篩選的多肽分子具有較好的靶向特異性,因而成為目前癌癥診療中最具有潛力的方法之一。研究表明針對黑色素瘤、肝癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌及鱗狀細胞癌等特定腫瘤有特異親和力的肽已被篩選出[5,6]。

噬菌體展示技術體外生物淘選(也常稱全細胞淘選)用于分離與細胞特定靶點連接的多肽,也就是將培養的完整細胞作為誘餌以達到分離各種細胞連接多肽的淘選方法。Liu等[7]利用噬菌體展示體外差減篩選方法,得到人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的靶向12肽序列GYSASRSTIPGK。Bcap-37細胞屬于浸潤性乳腺髓樣癌細胞,是一種特殊的組織學類型,一般分化較低,預后不佳[8]。但根據國內外文獻目前尚無篩選Bcap-37細胞靶向肽的報道。

本研究使用全細胞體外差減篩選方法對噬菌體隨機七肽庫與乳腺癌Bcap-37細胞進行了4輪篩選。隨著篩選次數獲得的噬菌體量逐漸提高,回收率也逐輪遞增,說明與乳腺癌Bcap-37細胞特異性結合的噬菌體得到了富集。隨機的選取20個生長良好的單克隆噬菌體斑,通過ELISA法鑒定其親和力。經對陽性單克隆噬菌體進行序列測定,得到的短肽LXRNTNX。本實驗成功篩選獲得了人乳腺髓樣癌Bcap-37細胞的靶向多肽分子,在今后的研究中將通過體內外實驗驗證短肽LXRNTNX對人乳腺癌細胞的特異性及親和力。本研究結果為乳腺癌早期診斷和靶向治療提供了可能的潛在靶點。