新疆地區帕金森病患者與ATP13A2基因多態性的相關性

王 丹,李艷霞,高 華,楊新玲*

(1新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830063;2新疆醫科大學第二附屬醫院康復科;3新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是當今僅次于阿爾茨海默病的第二大神經系統退行性疾病。該病在60-65歲人群中發病率約為0.5%-1%,而在80歲以上人群中其發病率上升至1%-3%[1,2]。PD患者可有漸進性的運動障礙,如靜止性震顫、肌強直、運動遲緩及姿勢步態異常;以及復雜的非運動癥狀包括精神癥狀如抑郁、焦慮、認知功能減退和視幻覺,自主神經功能障礙如便秘、直立性低血壓、性功能障礙,感覺癥狀如嗅覺減退、疼痛、肢體麻木,以及睡眠紊亂[3]。PD的發病機制復雜,目前尚未完全明確,目前研究認為老齡化、基因和環境因素均可能與PD發病相關[4]。雖然帕金森病中神經元變性的分子機制仍不完全明確,目前比較明確的是,遺傳因素對該病的發病有重要的影響。最近的全基因組關聯研究[5-7]已經確定了幾個常見的基因,包括α-synuclein基因、LRRK2基因、Parkin基因、DJ-1基因、UCHL1基因、NURR1基因、PINK1基因、FBX07基因、PLA2G6基因、GIGyF2基因、GBA基因和ATP13A2(PARK9)基因等。近幾年,ATP13A2基因成為PD基因遺傳發病機制研究的熱點之一。報道顯示[8-10],ATP13A2基因是PD的易感致病基因,但在不同種族人群中,帕金森病患者ATP13A2基因的突變類型和突變頻率還有所差異。新疆地區有著特殊的地理和人文環境,但目前對于新疆地區不同民族帕金森病患者ATP13A2基因多態性尚缺乏相關研究。我們通過SangerDNA測序技術檢測并分析新疆地區漢族、維吾爾族帕金森病患者5個SNP位點的多態性,探討ATP13A2基因多態性與帕金森病之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013-08～2018-03就診于新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科的散發性PD患者218例為病例組,平均年齡(63.34±10.38)歲。漢族患者143例:其中男67例,女76例;維吾爾族患者75例:其中男45例,女30例。以上PD患者均符合以下納入標準:①患者的臨床表現均符合英國帕金森病協會腦庫臨床診斷標準[11];②長期生活在新疆地區(2代及以上);③臨床資料完整且完善量表評估。排除標準:①腦血管病、外傷、腦炎、藥物等所引起的帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征、家族性帕金森綜合征、肝豆狀核變性患者;②伴有各種嚴重器質性疾病患者,如心肺功能不全、血液病、惡性腫瘤、肝腎功能不全者。同時選取就診于新疆醫科大學第二附屬醫院的健康體檢者234例為對照組,其中維吾爾族90例,漢族144例。男性113例,女性121例,平均年齡(62.06±9.44)歲。病例組與對照組在年齡、性別、民族方面差異無統計學意義(P>0.05)。該研究經新疆醫科大學倫理委員會認可,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

抽取外周靜脈抗凝血2 ml,置于含800 μl乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,并嚴格按照試劑盒中配套說明書操作。在紫外線分光光度計上,以稀釋DNA的緩沖液為對照測定基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值,這兩處波長的吸光度分別反映堿基中的共軛健和蛋白的含量。當A260/A280為1.7-1.9,判定為DNA樣本合格。將提取的DNA樣本放于-20 ℃保存、備用。

1.2.1 引物設計與合成 引物設計是通過檢索美國國立生物技術信息中心(NCBI)公共數據庫中ATP13A2基因序列,根據引物設計原則并參照相關文獻[12]進行設計,確定引物序列后由上海生工公司合成(引物參數見表1)。

表1ATP13A2基因序列PCR引物

Table1PCRprimersforATP13A2gene

位點 引物序列(5′-3′)PCR產物長度(bp)rs56367069F3:TCCATCTGCCTGTCGCTGTA311R3:TGGAGTCCACCCACTCTTCCrs2076603F:ACCCACCATTCAGTCTCCCAT492R:ATTCTGTGCCAATGCCCAACCrs56379718F4:TTCCTACTCCAGCCCCGTT363R4:AAGAGCGGGACCTGCCTAATrs151117874F4:TGCCTCCCCAAATGACCTTTC484R4:CTCACTGCGCTTCTCTAGCCrs147277743F3:CCCACCCACTCTGAGGACTA365R3:CAAGGGCCCAAAAAGATGCC

F:上游引物;R:下游引物

1.2.2 PCR反應條件 反應體系共30 μl:10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,TaKaRa TaqTM Polymerase(5 U/μl)3 μl,DNA模板10-20 ng,加去離子水至30 μl。整個PCR擴增反應在美國ABI公司生產的Verity 96well PCR儀中進行。反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃(-1 ℃/cycle)退火30 s,72 ℃延伸60 s,反復15個循環;95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,反復20個循環,保存于4 ℃。所得PCR產物加樣10 μl于2%瓊脂糖凝膠中,以120 V電泳30 min,于紫外光凝膠成像儀下觀察,確定所得產物為所需研究片段。5個反應位點反應條件基本相同。

1.2.3 SangerDNA測序 實驗中對于判斷ATP13A2基因5個位點的突變,我們取PCR所得產物10 μl,送上海生工生物公司與基因組ATP13A2基因標準序列比對,直接測序以確定DNA序列。

1.3 統計學方法

該實驗為病例-對照研究,實驗數據選用統計軟件SPSS 20.0進行分析。年齡為計量資料,若符合正態分布,兩組比較采用t檢驗,若不符合正態,數據用中位數±四分位間距表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。性別及族別為計數資料,采用χ2檢驗。基因頻率和基因型的分布采用基因計數法,基因型資料采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗,計數資料以例數和率(%)表示,兩組間相互比較采用χ2檢驗和(或)Fisher精確概率法。采用Logistic回歸分析各位點與帕金森病發病風險的相關性。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

剔除部分DNA質檢不合格樣本,所得出的一般資料結果見表2。病例組與對照組之間性別、年齡、族別差異無統計學意義(P>0.05)。病例組≤50歲早發性帕金森病(EOPD)27例,>50歲晚發型帕金森病(LOPD)191例。對照組≤50歲33例,>50歲201例。

表2帕金森病例組與對照組一般臨床資料的比較

Table2Characteristicsoftheincludedpopulation

組別女/男(例)年齡(歲)漢族/維吾爾族(例)病例組106/11264.00±15.00143/75對照組121/11362.50±16.00144/90χ2/U0.430-1.8330.802P0.512?0.067#0.371?

*Pearson Chi-square;#Mann-WhitneyUtest

2.2 Hardy-Weinberg檢驗

本研究經Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗法檢驗后,病例組與對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,吻合度良好(見表3)。

2.3 ATP13A2基因多態性分析

ATP13A2基因的五個位點經PCR擴增后為大小不等的片段(見圖1)。218例PD患者及234例健康對照組經DNA測序,ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位點基因型均為GG型,未見AG型或AA型突變;rs56379718(Gly49Ser)位點基因型均為CC型,未見CT型或TT型突變;rs151117874(Thr12Met)位點基因型均為GG型,未見AG型或AA型突變。218例PD患者中rs147277743(Ala746Thr)位點基因型僅有1例漢族患者為AG型(見圖1A),且該患者為早發型帕金森患者(EOPD);其余217例PD患者基因型均為GG型,未發現有AA型。rs2076603位點基因型有AA、AG、GG三種(見圖1B-D),其分布頻率見表3。

表3帕金森病例組與對照組基因多態性檢測結果例(%)

Table3ResultsofpolymorphismtestbetweenPDgroupandcontrolgroupcases(%)

基因位點n基因型等位基因 GGAGAA GAHWE(P)rs56367069 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs151117874 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs147277743 病例組218217(99.54)1(0.46)0(0)435(99.77)1(0.23)0.972923 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs2076603 病例組21888(40.37)93(42.66)37(16.97)269(61.70)167(38.30)0.15 對照組23472(30.77)109(46.58)53(22.65)253(54.06)215(45.94)0.341rs56379718 CCCTTT CT 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-

HWE：Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗;-：未能進行檢驗

圖1 ATP13A2基因多態性Figure 1 ATP13A2 gene polymorphism

2.4 維吾爾族、漢族病例組與對照組的ATP13A2基因五個位點的基因型及等位基因的分布

維吾爾族病例組與對照組rs56367069(Arg294Gln)位點、rs56379718(Gly49Ser)位點、rs151117874(Thr12Met)位點、rs147277743(Ala746Thr)位點和rs2076603位點基因型及等位基因分布間差異無統計意義(P>0.05);漢族病例組與對照組rs56367069(Arg294Gln)位點、rs56379718(Gly49Ser)位點、rs151117874(Thr12Met)位點、rs147277743(Ala746Thr)位點基因型及等位基因分布間差異無統計意義(P>0.05)。ATP13A2基因rs2076603位點的基因型GG、AG和AA在漢族PD病例組與對照組中的分布比較,差異具有統計學意義(P<0.05);rs2076603位點的等位基因G和A在兩組中的分布比較,差異具有統計意義(P<0.05,見表4)。

2.5 ATP13A2基因rs2076603位點的單因素分析及分層分析

2.5.1 ATP13A2基因rs2076603位點不同基因型遺傳模型的單因素Logistic回歸及分層分析 在隱性模型中,GG基因型攜帶者患PD的風險是AG或AA型攜帶者的0.657倍(P<0.05,見表5)。

2.5.2 ATP13A2基因rs2076603位點的分層分析 根據性別、民族、年齡對Logistic回歸進行分層校正:在男性的顯性模型中,GG或AG攜帶者患PD的風險是AA攜帶者的0.505倍(P<0.05),在男性等位基因模型中,A等位基因是PD的保護因素,攜帶A等位基因患PD的風險是攜帶G等位基因者的0.612倍(P<0.05,見表6)。

在漢族隱性模型中,GG攜帶者患PD是AG和AA攜帶者的0.522倍(P<0.05),在漢族等位基因模型中,A等位基因是PD的保護因素,攜帶A等位基因患PD的風險是攜帶G等位基因者的0.616倍(P<0.05,見表7)。

在大于50歲等位基因模型中,A等位基因是PD的保護因素,攜帶A等位基因患PD的風險是攜帶G等位基因者的0.751倍(P<0.05,見表8)。

表4帕金森病例組與對照組基因型及等位基因分布

Table4GenotypicandallelicdistributioninPDgroupandcontrolgroup

位點 組別基因型等位基因GGAGAAχ2PGAχ2Prs56367069 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs151117874 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs147277743 漢族病例組142100.49828510.498對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs2076603 漢族病例組5762247.7870.021761108.2110.004對照組376938143145 維吾爾族病例組3131130.1640.92193570.0270.869對照組35401511070rs56379718CCCTTTCT 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800

-:未能進行檢驗

表5兩組間ATP13A2基因rs2076603位點基因型不同遺傳模型的比較

Table5ComparisonofgeneticmodelsofATP13A2atrs2076603betweenthetwogroups

組別顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組181/3788/130167/269對照組181/5372/162215/253OR0.6980.6570.731P0.1320.0330.02

表6不同性別中rs2076603位點基因型不同遺傳模型的比較(例)

Table6Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinmalesandfemales(cases)

組別女性男性顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組89/1741/6582/13092/2047/6585/139對照組102/1938/83102/14079/3434/79113/113OR1.0250.7260.8660.5050.5950.612P0.9450.2520.4530.0330.0640.01

表7不同民族中rs2076603位點基因型的不同遺傳模型的比較(例)

Table7Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinHanandUgyurpopulation(cases)

組別漢族維吾爾族顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組119/2457/86110/17662/1331/4457/93對照組106/3837/107145/14375/1535/5570/110OR0.5630.5220.6161.0481.1070.963P0.050.0110.0040.910.750.869

表8不同年齡rs2076603位點的遺傳模型(例)

Table8Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsindifferentages(cases)

組別≤50歲>50歲顯性[(GG+AG)/AA]隱性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)顯性[(GG+AG)/AA]隱性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)病例組24/313/1417/37157/3475/116150/232對照組28/59/2429/37153/4863/138186/216OR0.70.4040.5860.690.7060.751P0.6480.0980.1640.140.1010.048

3 討論

近年來多項研究均表明ATPl3A2基因是PD的易感致病基因[8-10]。我們通過采用SangerDNA測序方法對新疆地區漢族、維吾爾族帕金森患者進行ATP13A2基因多態性研究。在本研究中我們發現,ATP13A2基因rs2076603位點的基因型GG、AG和AA在漢族PD病例組與對照組中的分布比較,差異具有統計學意義(P<0.05);rs2076603位點的等位基因G和A在兩組中的分布比較,差異具有統計意義(P<0.05),提示ATP13A2基因的rs2076603位點與PD的發生有相關性。分層分析中發現,在男性等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.612倍(P<0.05);在漢族等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.616倍(P<0.05);在大于50歲等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.751倍(P<0.05),rs2076603的A等位基因在不同性別、族別、年齡中有顯著差異,提示A等位基因可能是PD的保護因素。在218例PD患者中我們發現1例患者rs147277743(Ala746Thr)位點突變,為雜合子基因突變AG,突變頻率為0.46%,該患者為46歲女性,為EOPD患者,該患者臨床表現以震顫及平衡障礙為主,由于突變樣本量少,與野生AA基因型無法做比較,今后的工作仍需擴大樣本量繼續進一步研究。在我國大陸及臺灣有研究結果顯示PD存在ATP13A2基因Ala746Thr和Thr12Met位點的突變,但其基因突變總體頻率較低[13-19]。我們的研究發現在218名PD病例組及234例對照組均未發現rs56367069(Arg294Gln)位點、rs56379718(Gly49Ser)位點、rs151117874(Thr12Met)位點多態性,與目前研究所報道的ATP13A2基因總體突變頻率較低的研究結果一致。

新疆的維吾爾族有著與漢族人種不同的遺傳背景[17-18,20],生活方式及飲食習慣也有不同,但是在本文中通過比較ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位點、rs56379718(Gly49Ser)位點、rs151117874(Thr12Met)位點、rs147277743(Ala746Thr)位點和rs2076603位點的基因型和等位基因分布發現,在新疆的維吾爾族與漢族兩民族PD患者中差異不明顯,維吾爾族病例組及漢族病例組分別與其相應民族的對照組多態位點基因型和等位基因頻率分布比較差異亦不明顯,提示該基因的多態位點在這兩個民族PD患者間可能存在較小的差異性。

大多數PD患者為散發性,但約10%-20%的PD患者具有家族遺傳史,遺傳因素在PD的發病中起了重要作用,在近些年的報道中,不斷發現新的PD致病基因位點,目前關于不同民族的PD易感基因的研究尚不足,我們將在今后的工作中進一步開展大樣本、多中心的臨床研究進行深入探討。