冰菜乙醇提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性①

李婷婷 蔡彩虹 郭志凱 戴好富 夏志輝 曾艷波③

(1 海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室 海南海口571101;2 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業農村部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室 海南海口571101;3 海南大學熱帶農林學院 海南海口570228)

冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.）屬番杏科日中的一年生草本植物，又名冰葉日中花、冰草、冰花、水晶冰菜［1］。冰菜原產于南非納米比沙漠等干旱地區，現在非洲、亞洲西部和歐洲等地區均有分布［2］。國內目前也在引種栽培，在云南、陜西、山東等地區已經有了冰菜的規模化種植［3］。冰菜因其葉子和莖的表面有大量凸起的鹽囊泡細胞，在陽光照射下反射光線，看起來像冰晶一樣美麗而得名［4］。近年來，隨著生活水平不斷提高，人們對具有保健作用的蔬菜越來越重視。冰菜中含有多種碳水化合物以及有機酸、酚類化合物、天然蘋果酸、黃酮類化合物等，并且還含有鉀、鈣、鈉等多種礦物質成分，是具有高營養價值的功能性蔬菜。并具有清除自由基和抗氧化活性、促進代謝、預防脂肪肝和動脈硬化、減緩糖尿病等功效［5-8］。

早老性癡呆癥（又稱阿爾茨海默氏病）是以包括記憶和認知功能在內的智力逐漸衰退為特征的致殘性神經系統疾病。它是老年人中最常見的癡呆類型，占所有癡呆病例的50%～75%，包括智力損傷、人格變化、精神錯亂，最終導致癡呆并失去理智和自理能力［9-10］。本癥的發病機制原因很多，目前尚不明確，認為是一種由多種病因引起的疾病，目前人們最為廣泛研究和接受的是“膽堿能缺失學說”［11-12］。乙酰膽堿酯酶是膽堿能神經纖維信號傳導中的一種關鍵性的酶，在膽堿能突觸間，主要負責在膽堿能突觸釋放后1毫秒內快速消除乙酰膽堿，從而可以精確控制肌肉收縮，來保證生物體內神經信號的正常傳遞［13-14］。乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前研究最多，作為治療老年性癡呆癥的一線藥物，并且只有6 種藥物獲得美國FDA 許可上市：他克林、利斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏、石杉堿甲和N-甲基-D-天冬氨酸受體阻滯劑美金剛。目前研究發現，他克林具有很強的副作用，尤其是肝臟毒性明顯，其余藥物也只能作用于輕度或中度早老性癡呆患者，起到減緩作用，并不能很好地進行治療。目前，其他的抑制劑正在研發中，使用乙酰膽堿酯酶抑制劑來治療由阿爾茨海默氏病引起的膽堿能失衡癥狀是一種合理的辦法［15-17］。因此，以天然產物為原料，尋找具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的植物源藥物成為關鍵。

目前，國內外對冰菜的研究主要集中在冰菜的營養價值、栽培種植以及景天酸代謝方面，冰菜作為兼性鹽生植物，具有很強的耐鹽性和耐旱性［18］。國外研究者常把冰菜作為景天酸代謝分子遺傳研究的有用模型［19］。而對其生物活性研究較少，本研究對冰菜的乙醇提取物及其乙醇提取物萃取后的四個部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性進行了研究，旨在為冰菜的有效開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

冰菜樣品于2018 年5 月采自中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所文昌耐鹽蔬菜種植基地。標本存于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所B502實驗室。

儀器及試劑：旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；電子計重秤（廈門佰倫斯電子科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；超純水裝置（廈門銳思捷水純化技術有限公司）；乙酰膽堿酯酶、他克林（Sigma 公司）；常用分析純有機溶劑（廣州化工和天津大茂公司）；濃硫酸（博濱嶺化工有限公司）；色譜溶劑（天津四友和天津康科德公司）；其他試劑均為重蒸工業試劑。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

將冰菜（50.0 kg）用閘刀切成2～3 cm 的小段，置于塑料桶內，用食用酒精提取3 次，將3 次浸泡得到的提取液合并，用濾紙過濾掉殘渣，得到冰菜提取液，之后用旋轉蒸發儀經減壓濃縮得到提取物浸膏（200.0 g）。將提取物用超純水溶解，使其均勻分散成乳濁液，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，并分別經減壓濃縮得到石油醚部分（96.6 g）、乙酸乙酯部分（18.0 g）、正丁醇部分（75.0 g）和水部分。

1.2.2 活性測試

采用Ellman 法［20-21］測定乙酰膽堿酯酶抑制活性，冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分均用DMSO 進行溶解，取110.0 μL 磷酸緩沖液（pH8.0）、10 μL待測樣品（50.0 μg/mL）和40.0 μL 乙酰膽堿酯酶（0.02 μg/mL）于96 孔板中，30.0℃恒溫20.0 min后加入DTNB（2.48 mg/mL）和碘化硫代乙酰膽堿（1.81 mg/mL）等體積混合液40.0 μL，反應體系總共200.0 μL，30.0 min后，405 nm處用酶標儀檢測吸光度（A）值，陽性對照為他克林，反應終質量濃度為0.08 μg/mL，陰性對照為DMSO，終濃度為0.1%，實驗重復3次，按照公式計算化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制率：

抑制率＝（E－S）/E，

式中，E為陰性對照平均A值，S為待測樣品的平均A值。

1.2.3 數據處理

冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性數據經Excel初步計算后，所有的試驗數據利用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 氏多重比較，試驗結果均采用平均值±標準差的形式表示，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

采用Ellman 法［20-21］測定冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結果表明，以他克林為陽性對照，冰菜乙醇提取物及萃取后各部分中，除水部分無活性外，其余各部分均有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性（表1）。石油醚部分乙酰膽堿酯酶抑制率最強，為（77.72±3.30）%。乙酸乙酯部分具有一定的乙酰膽堿酶抑制活性，抑制率為（48.38±1.28）%。乙醇提取物（16.03±0.12）% 和 正 丁 醇 部 分（30.06±0.79）%對乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱。水部分沒有檢測到乙酰膽堿酯酶抑制活性。石油醚部分乙酰膽堿酯酶抑制率最強，達到（77.72±3.30）%，較陽性對照組他克林的抑制活性高出4%左右，對冰菜乙醇提取物及萃取后各部分和他克林對乙酰膽堿酯酶抑制活性進行單因素方差分析并進行t檢驗發現，石油醚部分與陽性對照的顯著性為0.013，差異達顯著水平（p＜0.05），說明石油醚部分中可能含有可以抑制乙酰膽堿酯酶活性的物質，值得進一步分離。乙酸乙酯部分、乙醇提取物和正丁醇部分對乙酰膽堿酯酶抑制活性與對照組顯著性均為0，差異達顯著水平（p＜0.05），對乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱。

表1 冰菜乙醇提取物及四個萃取部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性

3 討論與結論

隨著世界人口逐漸老齡化，越來越多的人有患阿爾茨海默病的風險。據調查，2006 年，全球約2 660 萬人患有阿爾茨海默病。預計到2050 年，這一數字將翻兩番，超過1億人患有該病［22-23］。目前已經批準上市的6種臨床常用的乙酰膽堿酯酶抑制劑都伴隨著不同程度的不良反應，例如惡心、頭暈、嘔吐、腹瀉、唾液增多以及肌無力等癥狀［24］。從天然植物中提取乙酰膽堿酯酶抑制劑已成為當前研究的熱點，國外研究者從多種植物中篩選出一些具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質，主要是生物堿類、萜類、天然黃酮類等化合物，其中主要用于臨床治療阿爾茨海默病的藥物，其活性成分主要都為生物堿類，其余種類化合物抑制活性較低［25］。本研究發現了冰菜中可能含有具有良好乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質，特別是冰菜乙醇提取物的石油醚萃取物表現出了與陽性對照他克林相近的乙酰膽堿酯酶抑制活性，由此猜測，如果可以從冰菜乙醇粗提物的石油醚部分中分離得到對乙酰膽堿酯酶具有抑制活性的化合物，則該化合物有潛力發展成為一個有效的、具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的先導化合物。因此，在接下來的工作中，主要以乙酰膽堿酯酶抑制活性為導向，對冰菜乙醇提取物的石油醚萃取部分以及乙酸乙酯部分進行進一步的分離純化，以期可以得到具有該活性的化合物。總體來說，冰菜除了具有豐富的營養價值，被用于食用外，其中含有的一系列的藥理活性物質同樣值得以活性為導向去分離，篩選并發掘其中具有生物活性的成分，為更好地開發與利用冰菜提供理論基礎。