苦瓜遺傳連鎖圖譜構建的研究現(xiàn)狀與比較分析①

劉子記 牛 玉 楊 衍

(中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 海南儋州571737)

苦瓜（Momordica charantiaL.， 2n = 2x =22）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）一年生蔓生草本植物，起源于非洲，共包括59 個種，其中47 個種分布于非洲，12 個種分布于亞洲和大洋洲，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)有著悠久的栽培歷史［1-2］。苦瓜富含維生素C、維生素E 及多種礦物質，具有很高的營養(yǎng)價值。另外，苦瓜所含的藥理活性成分具有顯著的抗腫瘤［3-4］、降血糖［5］、消炎［6］和提高人體免疫力［7］等多種功效。隨著消費者對苦瓜營養(yǎng)價值和藥用價值的充分認識，苦瓜生產迅速發(fā)展，推動了苦瓜研究工作的深入開展。構建遺傳連鎖圖譜是分析遺傳變異、基因定位和進行分子標記輔助育種的基礎。近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展，苦瓜遺傳連鎖圖譜的構建研究取得了較大的進展，大大促進了重要農藝性狀基因的定位及比較基因組學研究。本文總結了苦瓜遺傳連鎖圖譜構建及數(shù)量性狀定位的研究進展，以期為苦瓜重要農藝性狀基因克隆及分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 基于一代、二代分子標記構建苦瓜遺傳圖譜的研究現(xiàn)狀與比較分析

張長遠［8］以野生苦瓜材料M041530 和栽培種苦瓜材料CY013 雜交產生的F2代作圖群體為材料，利用SRAP 標記構建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜包括127 個標記，共18 個連鎖群，圖譜全長2094.2 cM，標記間的平均距離為16.5 cM（表1）。圖譜上存在明顯的3 個偏分離區(qū)域，分別位于第LG-8、LG-9和LG-18連鎖群上。采用復合區(qū)間作圖法對單株產量、單株結果數(shù)量、果實縱徑、果實橫徑、肉厚、單果重量等性狀進行了QTL分析，分別找到控制單株產量、單株結果數(shù)量、果實縱徑、果實橫徑、單果重量等QTL 各1 個，遺傳貢獻率分別為11.66%、16.05%、13.59%、11.66%和14.03%。盡管SRAP 標記可以用于構建遺傳圖譜，但通用性較差，該遺傳圖譜標記數(shù)目較少，標記間的遺傳距離較大，很難篩選到與目標性狀緊密連鎖的標記，另外，研究中定位的QTL位點能夠解釋的遺傳變異較小，多屬于微效基因位點。

Wang 等［9］以苦瓜雌性系Z-1-4 和自交系189-4-1 雜交產生的F2群體為試驗材料，基于SSR、AFLP 和SRAP 標記構建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜共194 個標記位點，包括26 個EST-SSR 標記位點，28 個SSR 標 記 位點，124 個AFLP 標記位點 和16 個SRAP 標記位點。圖譜全長1 009.5 cM，共包括12個連鎖群，標記之間的平均距離5.2 cM（表1）。在構建遺傳圖譜的基礎上對22 個農藝性狀進行了QTL 定位，在3 個環(huán)境中共檢測出9 個穩(wěn)定的主效QTL 位點，其中2 個QTL 位點控制雄花高度，2 個QTL 位點控制雄花節(jié)位，1 個QTL 位點控制雌花節(jié)位，2個QTL位點控制雌花節(jié)率，2個QTL位點控制單株產量。QTL 分布熱點區(qū)域位于LG-1、LG-4 和LG-5 連鎖群，這些熱點區(qū)域可能具有一因多效。本研究與張長遠［8］的研究結果相比，標記數(shù)量有所增加，并且采用了SSR標記，可用于圖譜間的比較研究，另外，本研究采用了AFLP 標記，進一步增加了圖譜密度，標記間的距離有所變小，但AFLP 標記和SRAP 標記通用性較差，難以進行圖譜整合研究。

米軍紅［10］以高抗白粉病野生苦瓜材料MC18 和高感白粉病苦瓜材料MC1-2 雜交產生的F2群體為研究材料，利用SRAP 和SCAR 標記構建了苦瓜遺傳圖譜并對抗白粉病基因進行了QTL定位，圖譜共包括11 個連鎖群，LG-1 長1 676.7 cM，共包括18 個標記，LG-2 長1 213.9 cM，共包括10 個標記，LG-3長154.6 cM，包括2 個標記，其余連鎖群各由1 個標記構成（表1），抗白粉病基因被定位在LG-2 連鎖群，鑒定出5 個與抗白粉病基因連鎖的SRAP 分子標記，并將其中1個SRAP標記轉化成SCAR標記。與張長遠［8］和Wang等［9］構建的遺傳圖譜相比，該遺傳圖譜的標記數(shù)量較少，盡管連鎖群的數(shù)量與苦瓜染色體數(shù)目一致，但多個連鎖群僅包括1個標記，很難說明連鎖群與染色體的對應關系。本研究基于該遺傳圖譜首次定位了抗白粉病基因位點，為苦瓜的抗病育種奠定了基礎。

Kole 等［11］以苦瓜品系臺灣白和CBM12 雜交產生的F2群體為研究對象，F(xiàn)2群體共包括146 個單株，利用AFLP 標記構建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜共包括11 個連鎖群，108 個AFLP 標記，圖譜全長3 060.7 cM，標記間的平均距離為22.75 cM，其中7 個連鎖群分別包括9～28 個標記，長234.7～889.8 cM，其余4 個連鎖群分別包括2～5 個標記，長16.6～78.5 cM。標記存在嚴重的偏分離現(xiàn)象（表1）。基于該圖譜定位了5 個質量性狀，分別為果實顏色、果實光澤、果實表皮結構、柱頭顏色和種子顏色。12 個控制果實形狀的QTLs 分別被定位在5 個連鎖群，能夠解釋11.1%～39.7%的表型變異。與張長遠［8］、Wang等［9］和米軍紅［10］構建的圖譜相比，該圖譜主要基于AFLP 標記，不僅標記間遺傳距離較大，并且標記在連鎖群上的分布存在明顯的偏分離情況。

綜上，基于一代、二代分子標記構建的苦瓜遺傳連鎖圖譜主要采用SRAP 和AFLP 分子標記，屬于顯性標記，盡管這些標記可以加速遺傳圖譜構建的進程，但通用性較差，不能有效進行遺傳圖譜的整合。另外基于顯性標記構建遺傳圖譜會過分估計連鎖群的長度，圖譜飽和度較低，定位的重要農藝性狀QTL較少，限制了其在分子輔助選擇方面的應用。與SRAP 和AFLP 標記相比，SSR 標記共顯性遺傳、易于操作，適合進行連鎖圖譜的構建及圖譜間的比較分析，Wang 等［9］開發(fā)利用了部分SSR 分子標記，但SSR 標記數(shù)量非常有限。為了進一步構建苦瓜高密度遺傳連鎖圖譜及加強圖譜間的比較分析需要進一步開發(fā)通用性較好，多態(tài)性較高，在染色體上分布較為均勻的分子標記。

2 基于第三代高通量分子標記構建苦瓜遺傳圖譜的研究現(xiàn)狀與比較分析

基于一代、二代分子標記構建的苦瓜遺傳圖譜飽和度較低，很難鑒定到與目標性狀緊密連鎖的分子標記，限制了其在苦瓜遺傳改良中的應用。為了構建苦瓜飽和的遺傳連鎖圖譜，確定與目標基因緊密連鎖的分子標記，需要進一步開發(fā)高通量的分子標記。近年來，基于下一代測序（next generation sequencing，NGS）的基因分型方法，包括限制性相關DNA 標記測序（restriction-associated DNA tag sequencing，RAD-seq）和基于測序進行基因分型（genotyping-by-Sequencing，GBS）被作為遺傳作圖的有效工具。這兩種方法對基因組中特定位置的短片段進行測序并計算其頻率，個體之間的DNA多態(tài)性表現(xiàn)為這些短序列的有無。這些基于測序的基因分型工具可同時鑒定數(shù)千個全基因組范圍的多態(tài)性。

Matsumura 等［12］為了鑒定與純雌性基因連鎖的分子標記，利用RAD-seq分析技術檢測基因組范圍的DNA 多態(tài)性，利用純雌性系OHB61-5 和雌雄同株系OHB95-1A 雜交產生的F2群體對多態(tài)性位點進行基因型分析，基于552 個共顯性的RAD-tag 標記構建了苦瓜連鎖圖譜，共包括15 個連鎖群，圖譜全長1 821 cM（表1）。純雌性位點Mcgy 被定位在第一連鎖群的末端，與Mcgy最近的標記為GT1998，該標記由一個等位性標簽組成，該SNP 在OHB61-5中為C 類型，在OHB95-1A 中為T 類型，GT1998 與Mcgy 位點的遺傳距離為8.33 cM。為了進一步開發(fā)與純雌性緊密連鎖的標記，構建了純雌性系混池和雌雄同株系混池，結合親本池，基于RAD-seq技術確定了與純雌性位點緊密連鎖的SNP 標記GTFL-1，該標記與Mcgy 位點的遺傳距離為5.46 cM。本圖譜包括的標記數(shù)量顯著高于張長遠［8］、Wang等［9］、米軍紅［10］和Kole 等［11］構建的圖譜，圖譜的密度顯著提高。但是在該研究中，連鎖群的數(shù)目（15 個連鎖群）并沒有覆蓋已知的染色體數(shù)目（11 條染色體），一些連鎖群只包含有限的標記數(shù)量。這些結果很可能是由于標記位置在分析群體中存在偏差，或者相同染色體上的連鎖群存在分離。為了解決這些問題，有必要增加標記密度或更換作圖群體。在RAD-seq分析時采用不同限制性內切酶可能會增加標記的數(shù)量。另外，增加F2個體的數(shù)量將有助于繪制精確的連鎖圖譜。然而，當一個作圖群體的雙親序列差異較小時，通過更換限制酶或增加群體規(guī)模來精確定位純雌性基因也是很困難的。

Urasaki 等［13］以OHB61-5 和OHB95-1A 雜交 產生的F2群體為研究對象基于RAD-seq 分析方法構建了苦瓜遺傳圖譜。圖譜共包括1423 個標記位點，11個連鎖群，圖譜全長3 426 cM（表1）。根據標記在參考基因組序列中的位置，可以將255個序列骨架錨定到所構建的連鎖圖上，每個骨架序列中的RAD 標記位置幾乎與遺傳圖譜中的順序一致。Urasaki 等［13］和Matsumura 等［12］基于相同的作圖群體構建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，但Urasaki 等［13］構建的圖譜飽和度更高，圖譜包含的標記數(shù)量高于Matsumura 等［12］的2 倍，圖譜長度幾乎是Matsumura 等［12］的2 倍，連鎖群的數(shù)目與苦瓜染色體數(shù)量一致。

遺傳作圖是錨定組裝序列和鑒定控制重要性狀QTLs 的基本工具。Cui 等［14］構建了一個基于RAD-seq 的苦瓜遺傳圖譜，作圖群體來源于純雌性系“k44”和雌雄同株系“dali-11”雜交產生的F2群體，共包括423個個體。該遺傳圖譜共包括11個連鎖群，1009個SNP標記，圖譜全長2 203.95 cM，標記間的平均距離為2.18 cM（表1）。該圖譜共錨定了113個組裝序列，全長251.32 Mb，占組裝基因組序列的85.48%。連鎖群重組率的變幅為6.91～11.04 cM/Mb。此外，采用定性和定量相結合的方法，對三個重要性狀進行了定位，包括性別表達、果實表皮結構和未成熟果實顏色。在三個環(huán)境中鑒定了3 個與這些性狀相關的QTL 位點，其中QTL位點gy/fffn/ffn 控制純雌性、第一雌花節(jié)位和雌花數(shù)量。兩個QTL 位點，F(xiàn)wa/Wr 和w，分別控制果實表皮結構和白色未成熟果實顏色。該遺傳圖譜的構建促進了苦瓜基因組的組裝，將進一步加速相關基因的克隆。該遺傳圖譜包含的標記數(shù)量顯著 高 于 張 長 遠［8］、Wang 等［9］、米 軍 紅［10］、Kole等［11］和Matsumura 等［12］構建的圖譜，與Urasaki等［13］構建的圖譜標記數(shù)量相當。該遺傳圖譜的平均標記密度為0.46 maker/cM，高于Matsumura等［12］（0.30 maker/cM） 和Urasaki 等［13］（0.42 maker/cM）的研究結果。該研究之所以標記密度較高，可能與選擇的限制性酶有關。該研究采用EcoRI 消化基因組DNA 進行RAD-seq 分析，但Matsumura 等［12］和urasaki 等［13］分別使用了PacI 和AseI。在未來，篩選使用其它限制酶或許有助于構建飽和的苦瓜遺傳圖譜。

Gangadhara Rao 等［15］建立了苦瓜高密度、高分辨率遺傳圖譜。共開發(fā)了2013 個高質量SNP 標記，圖譜共包括20個連鎖群，全長2 329.2 cM，每個連鎖群的長度從LG-12 185.2 cM到LG-17 46.2 cM不等，連鎖群的平均長度為116.46 cM。每個連鎖群中的SNP 標記的數(shù)量從LG-20 中的23 個標記到LG-1 中的146 個標記不等，平均每個連鎖群含有100.65 個SNP 標記。20 個連鎖群標記之間的平均距離為1.16 cM（表1）。每個連鎖群標記之間的平均距離從LG-4 0.70 cM 到LG-20 2.92 cM 不等。共鑒定出與4個性狀（雌性、性別比、節(jié)位和雌花始花期）相關的22個QTLs位點，分布在20個連鎖群上。gy-1 基因位點被定位在第12 連鎖群上，兩側的標記為TP_54865 和TP_54890，與TP_54890 的距離為3.04 cM。該遺傳圖譜包括的標記數(shù)量顯著高于張長遠［8］、Wang 等［9］、米軍紅［10］、Kole 等［11］、Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］構建的苦瓜遺傳圖譜。標記密度（0.86 marker/cM）顯著高于Matsumura 等［12］（0.30 marker/cM）、Urasaki 等［13］（0.42 marker/cM）和Cui 等［14］（0.46 marker/cM）的研究結果。本研究構建的遺傳圖譜共包 括20 個連 鎖群，明 顯 多于Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］的研究結果，遠遠超過了苦瓜單倍體染色體數(shù)目，這可能是由于F2群體過小或與作圖群體的類型有關。為了解決這些問題，可以試圖通過增加作圖群體規(guī)模或采用RIL群體替換F2作圖群體進行改善。本研究進一步說明，在構建苦瓜遺傳圖譜研究中，GBS 技術略優(yōu)于RAD-seq技術。

表1 苦瓜遺傳連鎖圖譜

3 結論

構建高密度的遺傳連鎖圖譜是分析遺傳變異、基因定位、基因克隆和進行分子標記輔助育種的基礎。圖譜的飽和程度及標記的類型是影響圖譜應用效果的關鍵［16］。盡管苦瓜遺傳圖譜的研究工作取得了一定進展，但仍存在一些不足。基于一代、二代分子標記構建的苦瓜遺傳圖譜，標記間的距離較大，飽和度較低，很難鑒定與目標基因緊密連鎖的分子標記。另外，基于一代、二代和三代分子標記構建的苦瓜遺傳圖譜均基于F2群體，利用F2群體構建遺傳連鎖圖譜進行相關QTL 分析具有一定的局限性，很難進行多年多點分析，由于RILs 永久作圖群體可以在不同時間和地點對性狀進行測量，可以大大降低試驗誤差，提高分析結果的準確度［17］。因此為了提高圖譜的精確度和準確度，在未來苦瓜遺傳圖譜的構建過程中，可以構建RILs 作圖群體，另外一方面可以比較整合現(xiàn)有遺傳圖譜，最終構建高密度的苦瓜遺傳連鎖圖譜。

本文總結了苦瓜遺傳連鎖圖譜構建的研究現(xiàn)狀，為進一步剖析苦瓜重要性狀基因關鍵位點奠定了基礎。有助于開發(fā)與重要農藝性狀緊密連鎖的分子標記，開展分子輔助選擇育種，推動苦瓜分子育種的進程。