黃連堿對過氧化氫損傷的血管內皮細胞保護作用

韋晟 劉金春 葛衛紅

[摘要] 目的 探討黃連堿對過氧化氫（H2O2）損傷的血管內皮細胞的保護作用及其機制。 方法 將體外培養的人臍靜脈內皮細胞（EA.hy926）分為對照組、模型組、給藥組。對照組加入新鮮培養基，模型組給H2O2刺激4 h，給藥組用不同濃度的黃連堿（2.5、5、10、20、40 μmol/L）預處理4 h，再用H2O2刺激4 h。采用MTS法檢測細胞活力，熒光探針-二氫乙啶（DHE）染色法檢測細胞內活性氧（ROS），Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，Western blot檢測凋亡相關蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的變化。 結果 與對照組比較，模型組細胞存活率和Bcl-2蛋白的表達明顯降低，細胞內ROS含量、細胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表達明顯升高（P < 0.01）;而與模型組比較，給藥組細胞的存活率和Bcl-2蛋白的表達均隨著給藥濃度的增加而逐漸升高，細胞內ROS含量、細胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表達均隨著給藥濃度的增加而逐漸下降，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 黃連堿是通過抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞存活率降低、細胞內ROS升高、細胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白表達的上調以及Bcl-2蛋白表達的下調，發揮其對H2O2損傷的血管內皮細胞的保護作用，且呈劑量依賴性。

[關鍵詞] 黃連堿;EA.hy926細胞;氧化應激;細胞凋亡

[中圖分類號] R54? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect and mechanism of coptisine on vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods Human umbilical vein endothelial cells （EA.hy926） cultured in vitro were divided into control group， model group and drug administration group. The control group was added with fresh medium， and the model group was stimulated by H2O2 for 4 h. The drug-treated group was pretreated with different concentrations of coptisine （2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L） for 4 h， and then stimulated with H2O2 for 4 h. Cell viability was detected by MTS assay， intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by ROS fluorescent probe - dihydroethidine （DHE） staining， apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining， and Western blot was used to detect the changes of apoptosis-related proteins caspase-3， Bcl-2 and Bax. Results Compared with the control group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of the model group were markedly decreased， whereas the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were significantly increased （P < 0.01）. However， compared with the model group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of dosing group were increased gradually with the increasing concentration of coptisine， while the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were decreased gradually with the increasing concentration of coptisine （P < 0.01）. Conclusion Coptisine exerts its protective effect on vascular endothelial cells injured by H2O2 in a dose-dependent manner by inhibiting the decrease of survival rate， the increase of ROS， the increase of apoptotic rate， the up-regulation of caspase-3 and Bax protein expression and the down-regulation of Bcl-2 protein expression in EA.hy926 cells induced by H2O2.

[Key words] Coptisine; EA.hy926 cell; Oxidative stress; Apoptosis

心血管疾病是嚴重危害人類健康的重大疾病[1]。血管內皮功能障礙已成為多種心血管疾病的關鍵調控因素[2]。氧化應激誘導血管內皮細胞損傷是誘發包括動脈粥樣硬化在內的多種心血管疾病的一個重要因素[3-4]。因此，尋找能夠對抗活性氧引起的氧化應激和細胞凋亡、可治療動脈粥樣硬化的自由基清除劑具有重要臨床意義。黃連堿是一種天然的原小檗堿型生物堿季銨鹽，存在于毛茛科和罌粟科的多種植物中[5]。黃連堿通過抗氧化、抑制RhoA/Rho激酶通路、抗心肌細胞凋亡和炎癥對心肌梗死的大鼠具有心肌保護作用[6-7]。然而，黃連堿的抗動脈粥樣硬化的作用機制至今尚不清楚。本研究擬探討黃連堿對過氧化氫（H2O2）損傷的血管內皮細胞的保護作用及其機制，為黃連堿防治心血管疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

EA.hy926細胞購自中科院上海細胞生物學研究所;DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司;細胞增殖和細胞毒實驗檢測試劑盒MTS購自美國Promega公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司;DHE-ROS活性氧檢測試劑盒購自北京威格拉斯公司;黃連堿、H2O2購自美國Sigma公司;caspase-3、Bax、Bcl-2、Tubulin、辣根過氧化物酶二抗購自美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS法檢測黃連堿對H2O2損傷的EA.hy926細胞存活率的影響? 取對數生長期的EA.hy926細胞，按照每孔約5×103個接種于96孔培養板中，100 μL/孔;待其貼壁后，分為對照組、模型組和給藥組;對照組加入新鮮培養基，模型組給予250 μmol/L的H2O2刺激4 h，給藥組用不同濃度的黃連堿（2.5、5、10、20、40 μmol/L）預處理4 h，其后用H2O2刺激4 h;每孔加入20 μL的MTS溶液，繼續孵育4 h后，在酶標儀上于490 nm波長測定各孔光密度值。

1.2.2 熒光探針-二氫乙啶（DHE）染色法檢測黃連堿對H2O2損傷的EA.hy926細胞內ROS的影響? 取對數生長期的EA.hy926細胞，按照每孔約1×105個細胞接種于12孔板中，每孔1 mL;細胞貼壁后，對照組和模型組處理方法同“1.2.1”，給藥組用低、中、高濃度的黃連堿（5、10、20 μmol/L）預處理4 h，再用H2O2刺激4 h;按照DHE-ROS活性氧檢測試劑盒上的說明檢測細胞中ROS含量。

1.2.3流式細胞術檢測黃連堿對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡的影響? 取對數生長期的EA.hy926細胞，按照每孔約2×105個細胞接種于6孔板，每孔1 mL，24 h后細胞貼壁，同上述實驗分組和給藥處理后，收集細胞，并按照Annexin V-FITC/PI試劑盒上的說明檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測EA.hy926細胞中凋亡相關蛋白的表達? 取對數生長期的EA.hy926細胞，按照每孔約5×105個細胞接種于直徑為6 cm的培養皿中，每皿3 mL，24 h后細胞貼壁，同上述實驗分組和給藥處理后，收集細胞并裂解，于4℃、12 000 g條件下離心15 min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度后，制備12%分離膠、5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，轉膜。5%的BSA封閉2 h后，caspase-3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、微管蛋白（Tubulin，1∶5000）于4℃下孵育過夜。用TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗膜3次，接下來電化學發光（ECL）顯色，并用Image J軟件進行定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 黃連堿對H2O2誘導的EA.hy926細胞存活率的影響

MTS實驗結果顯示，與對照組比較，模型組的細胞存活率顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，2.5 μmol/L給藥組細胞存活率沒有明顯變化，差異無統計學意義（P > 0.05）;5、10、20、40 μmol/L給藥組細胞存活率明顯升高，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。

2.2 黃連堿對H2O2誘導的EA.hy926細胞內ROS的影響

DHE染色結果顯示，與對照組比較，模型組中紅色熒光強度顯著增強，提示細胞中ROS含量明顯升高;與模型組比較，給藥組紅色熒光強度隨著給藥濃度的增加逐漸減弱，提示細胞中ROS含量降低。

2.3 黃連堿對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示，與對照組比較，模型組中細胞凋亡率明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與模型組比較，給藥組細胞凋亡率隨著給藥濃度的增加逐漸降低，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。

2.4 Western blot檢測EA.hy926細胞中凋亡相關蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，模型組細胞內caspase-3和Bax蛋白表達量明顯增加，而Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）;與模型組比較，給藥組細胞內caspase-3和Bax蛋白的表達均隨著給藥濃度的增加而逐漸下調，而Bcl-2蛋白表達水平隨著給藥濃度的增加而逐漸上調，從而降低Bax/Bcl-2的比值，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。

3 討論

動脈粥樣硬化引起的心血管疾病嚴重危害著人類健康[8]。氧化應激貫穿動脈粥樣硬化斑塊的形成、發展及斑塊破裂觸發臨床事件的始終，被認為是其致動脈粥樣硬化發生、發展的重要機制[9-10]。氧化應激是指機體產生過量的ROS與清除ROS的抗氧化系統之間的失衡，導致體內的ROS增多，并引起細胞氧化損傷的過程[11]。在培養基中添加H2O2引起的氧化損傷過程與體內ROS誘導細胞損傷的病理過程相類似[12]。因此，本研究采用H2O2體外誘導EA.hy926細胞制備氧化應激模型，觀察黃連堿對血管內皮細胞的保護作用及其機制。

本研究首先通過MTS法檢測不同濃度黃連堿對H2O2損傷的EA.hy926細胞存活率的影響，結果表明，黃連堿能夠抑制H2O2導致的EA.hy926細胞氧化損傷，且在5～20 μmol/L呈明顯的濃度依賴性。DHE法檢測細胞內ROS的結果進一步證實黃連堿具有抑制H2O2誘導的細胞氧化應激的作用。

當血管內皮損傷或暴露于ROS時，會導致內皮細胞發生凋亡[13]。通過Annexin V-FITC配合PI進行雙染，并利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，可以用來區分正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞，并反映出細胞凋亡的進程[14]。本研究顯示，H2O2處理后細胞凋亡率明顯升高，其中尤以晚期凋亡為主，達到49.18%;黃連堿給藥組細胞凋亡率顯著降低，當給藥濃度為20 μmol/L時，細胞凋亡率僅為4.54%，提示黃連堿在一定程度上能抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡的發生，且呈良好的濃度依賴性。細胞的凋亡與抗凋亡間存在一種精細平衡，這種平衡一旦被打破，則可啟動細胞的凋亡程序[15]。

細胞凋亡是機體在內外環境刺激下啟動的由基因調控的細胞死亡過程，ROS能夠激活凋亡啟動分子，從而促使細胞凋亡的發生[16]。在細胞凋亡過程中，caspase-3占據核心地位，被稱為“死亡執行蛋白酶”[17]。因此，caspase-3的激活常被為作為判斷細胞凋亡的可靠指標之一。本研究發現，H2O2能夠使細胞內caspase-3蛋白表達量明顯增加;黃連堿能顯著下調caspase-3蛋白的表達。此外，caspase的活性在凋亡發展過程中也可被細胞內眾多的蛋白質調節，如Bcl-2家族蛋白分子[18]。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中發揮著重要的調控作用，其中Bax/Bcl-2的比例決定了細胞對誘導凋亡信號的敏感性[19-20]。本研究結果顯示，黃連堿呈濃度依賴性地抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞中Bax表達上調、Bcl-2的表達下調，從而顯著降低Bax/Bcl-2的比值，最終抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡。

綜上所述，本研究采用H2O2誘導的EA.hy926內皮細胞氧化損傷模型考察黃連堿的抗氧化損傷作用。結果表明，黃連堿通過抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞存活率降低、細胞內ROS升高、細胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白的表達上調以及Bcl-2蛋白表達的下調，從而發揮其對H2O2損傷的血管內皮細胞的保護作用。因缺乏體內實驗的驗證，本研究的結果具有一定的局限性，但本研究為黃連堿的進一步開發提供了一定的理論基礎。

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（收稿日期：2018-05-14? 本文編輯：王? ?蕾）