共焦顯微鏡在角膜病變中應用的新進展

鄭 巧，張 琪

0引言

共焦顯微鏡(confocal microscopy, CM)檢查作為一種“活體組織學檢查”方法，以其實時、無創、快速、高清的特點，已在眼科臨床及科研中得到廣泛應用。其放大倍率可達800倍，分辨率可達1μm，能夠從細胞水平對活體角膜組織進行觀察，在角膜生理、病理研究及疾病診斷、病情評估、隨訪等方面顯示出優越性。

1共焦顯微鏡在感染性角膜疾病中的應用

1.1真菌性角膜炎真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)近年發病率呈上升趨勢，其病程遷延，是導致角膜盲的常見原因，早期診斷并啟動有效的抗真菌治療是改善其預后的重要因素。角膜刮片鏡檢及培養是FK診斷的金標準，但絲狀真菌生長緩慢，其培養可能需數周，且敏感性低，陽性率不到50%[1]。角膜組織病理學檢查及PCR技術已用于診斷FK，但限于其侵入性，難以早期實施。CM可無創、快速的檢測角膜中的真菌。CM下真菌菌絲多呈高反光的線型結構，可見分節或分支，呈竹節狀或樹枝狀，叢狀雜亂排列。鐮刀菌屬分支夾角多為90°，曲霉菌屬多為45°，據此可做出初步鑒別。孫曉會等[2]對比分析了CM與角膜刮片鏡檢在FK診斷中的作用，發現CM有更高的陽性診斷率，觀察到的菌絲和孢子與角膜刮片檢查所見相似，對于病程較長，已使用抗真菌藥物或已行病灶刮除等治療的患者，兩者診斷敏感度均下降。有學者就檢查者經驗在CM診斷FK中的影響做了研究，發現有經驗的檢查者診斷的平均敏感度為71%，缺乏經驗的檢查者為43%，所有檢查者診斷的特異性為75%或更高，顯示檢查者經驗在CM的診斷準確性中扮演重要角色。目前，CM的分辨率還不能滿足對真菌微細結構的觀察，無法準確鑒別菌種。近期Chidambaram等[3]使用CM觀察不同病原體所致FK的角膜細胞變化，發現前基質星狀細胞與鐮刀菌性角膜炎相關，樹突狀細胞與曲霉菌性角膜炎相關，提示角膜細胞的反應可能具有一定特異性，為菌種鑒別提供線索。

1.2棘阿米巴性角膜炎棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis, AK)由棘阿米巴原蟲感染所致，較真菌性角膜炎、細菌性角膜炎等少見，近年隱形眼鏡使用的增加使其發病率明顯上升，隨地區不同，每10000名隱形眼鏡配戴者有0.01～1.5名感染棘阿米巴原蟲[4-5]。由于早期臨床表現缺乏特征性，AK常被誤診為單純皰疹病毒性角膜炎、細菌性角膜炎或真菌性角膜炎[6-7]。據報道，在培養物中分離出棘阿米巴的概率為0～68%[8]。棘阿米巴有滋養體和包囊兩種形態，體積均較大(>10μm),在CM下呈圓形或卵圓形、高反光，易于檢出。1992年Chew等[9]首次報道通過CM診斷AK。此后許多研究者研究并肯定了CM對AK的診斷意義，但報道的診斷靈敏度、特異性不一。王玉亭[10]回顧分析了58例AK，發現CM的檢出率為86.4%，其中32例根據CM確定的感染范圍切除病灶，實施角膜移植術，取得滿意效果。據文獻報道，棘阿米巴包囊可長期存留于角膜組織中，最長達31mo，角膜炎癥控制后仍需藥物治療3～4mo[11]。感染后期角膜上皮愈合，此時可利用CM隨訪觀察，指導治療?，F有研究對棘阿米巴在CM下的表現描述各異。近期Craene等[12]首次參照PCR對CM診斷AK的價值進行了評估并研究了其診斷標準，認為4種影像與AK顯著相關：亮點(沒有雙壁結構的圓形或卵形高反射物)，目標圖像(具有低反射光暈的高反射物)，滋養體樣圖像(直徑>30μm，表面呈棘狀突起的高反射物)和高反射物體簇。其中目標圖像和滋養體樣圖像診斷特異性最高，為100%，但敏感性最低，分別為8.7%和10.9%，因此需要尋找多方面證據確定診斷。Chidambaram等[3]發現，滋養體樣圖像可形成簇，尤其在局部類固醇治療后的病例。Zhang等[13]對29例AK進行觀察，發現滋養體樣圖像的線性或成簇排列與預后不良相關。另有研究者在病程較長的AK中觀察到滋養體樣圖像簇狀排列，且比例很高，這些患者曾使用局部類固醇治療[14]。滋養體樣圖像的簇狀排列是否是AK有用的預后指標還需要更大量的研究確定。這些研究提示，CM可能提供診斷以外的更多信息。

1.3病毒性角膜炎單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是發達國家最常見的感染致盲原因[15]。原發性角膜感染后，單純皰疹病毒進入三叉神經節，終生潛伏并周期性激活，引起復發性HSK[16]。其嚴重并發癥之一是神經營養性角膜病變[17]。CM雖然無法分辨病毒，但可用于HSK的病理研究。Müller等[18]使用CM觀察HSK后角膜瘢痕形成眼及對側臨床未受累眼，發現瘢痕眼角膜內皮細胞密度、總神經長度顯著低于健康對照組，對側眼亦相應降低，兩者角膜內皮細胞密度與總神經長度、角膜知覺呈正相關，推測單側HSK后，雙側角膜神經受損，神經肽水平降低，內皮細胞損失。

2共焦顯微鏡在變性性角膜疾病中的應用

2.1角膜營養不良角膜營養不良包括一大類與家族遺傳有關的原發性進行性角膜疾病，以角膜異常物質沉積為共同特征，表現各異，根據主要受累層次分為上皮和上皮下營養不良、上皮-基質TGFBI營養不良、基質營養不良和內皮營養不良四類。CM是觀察CD組織特征的有用工具。Meesmann角膜營養不良主要累及上皮層，表現為上皮囊泡樣病變，囊泡突起或破裂后引起眼部不適，可被誤診為干眼。CM下其上皮細胞間存在多量圓形或卵圓形囊泡，大小不一，邊界清晰，多呈高反光，內部可含高反光結構，亦可見單獨的高反光結構散在于細胞間，在病變區域與正常區域間可見明顯的分界[19]。顆粒狀角膜營養不良屬上皮-基質TGFBI營養不良一類，表現為Bowman 膜下及淺基質層內白色顆粒狀物質沉著，逐漸融合成片，形成盤狀、雪花狀等外觀[20]。CM下可見Bowman 膜不規則增厚，反光增強，基質層結構紊亂，出現大片高反光，其間可見短棒狀強反光結構。Fuchs角膜內皮營養不良(Fuchs’ endothelial corneal dystrophy，FECD)是較常見的一種CD，相關研究較多。遺傳突變和環境觸發因素如氧化應激等引起內皮細胞凋亡，異常膠原沉積，后彈力膜增厚，滴狀贅疣形成，最終導致角膜水腫和視力下降[21-22]。利用CM對FECD進行分級，與臨床主觀分級有很好的相關性，CM可作為FECD研究的有用工具[23]。FECD患者角膜基底膜下神經形態異常，敏感性下降。幾項研究顯示晚期FECD角膜神經減少或缺失，認為其歸因于角膜水腫[23-24]。 Aggarwal等[25]通過前瞻性研究發現，FECD大多數神經改變已經存在于早期，伴有樹突細胞(dendritic cell, DC)顯著增加，顯示免疫激活和神經缺失可能參與FECD的發病機制。研究表明，FECD前角膜結構和細胞在早期出現異常，這解釋了為什么角膜后彈力層剝除聯合深板層內皮移植術(descemet’s stripping endothelial keratoplasty, DSEK)后角膜結構和光學功能不能恢復正常[26]。隨著技術進步，更精準的DSEK帶來更好的預后，此時宿主角膜早期的亞臨床變化與術后視覺結果更加相關。Amin等[27]使用CM觀察角膜基質細胞密度、數量及異常上皮下細胞，根據共焦圖像光強度分布測量角膜背向散射，發現FECD各期患者的前角膜背向散射升高，基質細胞密度和前10%角膜基質細胞絕對數降低，可見異常上皮下細胞，這些改變在DSEK后持續存在，影響術后視力和視覺質量[28]。對這些變化的深入研究可能有助于揭示FECD的最佳干預時間。

2.2圓錐角膜圓錐角膜是一種雙側性、進行性、角膜擴張性疾病，由于不規則散光或角膜混濁損害視力，晚期常需角膜移植[29]。其病因目前尚不清楚，可能涉及許多因素，包括生化、遺傳和環境。早期診斷圓錐角膜有賴于角膜地形圖，其通過計算機圖像處理系統精確分析整個角膜表面的形態和曲率的變化，診斷靈敏度、特異度高。CM從組織學角度觀察角膜，可發現圓錐角膜的早期改變，如后基質層出現褶皺樣暗紋、細胞拉長等，與角膜地形圖具有良好的互補性。此外，CM在圓錐角膜治療方法的探索上具有重要價值。角膜膠原交聯(corneal collagen cross-linking, CXL)是治療圓錐角膜的一種成熟技術，已被證明可以減緩或阻止其進展，具有長期的安全性和有效性，為避免紫外線對內皮造成不可逆損傷，常規CXL要求去除上皮后角膜厚度在400μm以上[30]。近年有學者提出，可通過增加功能性角膜厚度來擴展適應證[31]。Mazzotta等[32]對圓錐角膜患者施行隱形眼鏡輔助的角膜膠原交聯(contact lens assisted collagen cross-linking, CACXL)：將隱形眼鏡浸泡于核黃素30min, 在照射紫外線前將其覆蓋于角膜表面，以增加功能性角膜厚度至400μm以上。術后使用CM隨訪觀察，術后3mo，患者角膜神經開始再生，到術后6mo，角膜神經完全修復，前基質細胞再生，周圍分布致密細胞外基質，水腫消失，隨訪期內內皮細胞規則，密度無明顯改變，顯示CACXL可能是薄圓錐角膜安全有效的治療選擇。治療范圍上，國內外學者也做了探索。Cassagne等[33]對比分析了地形圖引導的角膜膠原交聯(topography-guided CXL, TG-CXL)與常規CXL對進展期圓錐角膜的療效和安全性。TG-CXL組根據角膜地形圖設計紫外線照射部位：以后角膜最高點為中心，包含前角膜異常軸向曲率范圍的錐形區域。術后通過CM發現TG-CXL組錐形區域和周圍區域間存在一模糊的分界線，周圍區域具有更輕微的去神經和細胞凋亡現象，恢復得更快——TG-CXL具有更顯著的平坦效應，誘導錐體和周圍區域間的生物學梯度，促進神經和細胞恢復，提高視敏度。Mastropasqua等[34]對10例晚期穩定圓錐角膜患者施行飛秒激光輔助的基質透鏡植入術，術后以CM觀察透鏡的存活情況，到術后6mo，透鏡內大部分細胞形態趨于正常，呈規則明亮的反光，細胞外組織呈正常的透明性，顯示基質透鏡已很好的整合于宿主角膜，肯定了該手術方式的有效性。

3共焦顯微鏡在全身疾病所致角膜病變中的應用

3.1糖尿病周圍神經病變糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病的主要長期并發癥之一，發病率在50%以上，嚴重威脅患者生存質量[35]。表皮內神經纖維密度(intra-epidermal nerve fiber density, IENFD)是評估小神經纖維病變的金標準，對早期診斷DPN有重要意義，但有創性限制了其在DPN診斷和研究中的應用。角膜富含末梢神經，是DPN重要受累部位之一。糖尿病患者角膜神經纖維密度下降，與IENFD改變顯著相關[36]。研究表明，CM具有與IENFD相當的診斷性能，可檢測小神經纖維的早期病變，有良好的重復性，具有快速和無創的優勢[37]。近期的一項薈萃分析匯總分析了13項研究，包括1680例受試者，獨立證實了角膜神經纖維密度、長度及其分支密度是區分有或沒有DPN的糖尿病患者與健康對照者的最佳參數[38]。Lovblom等[39]報道，隨訪1型糖尿病患者約4a，DPN發生率為17%，基線角膜神經纖維長度小于14.9mm/mm2是發生DPN的最強預測因素。

3.2干燥綜合征干燥綜合征(Sj?gren syndrome, SS)是一類主要累及唾液腺和淚腺的慢性、炎癥性、自身免疫性疾病，包括原發性和繼發性兩類。眼表炎癥是干眼的關鍵事件。Hitomi等[40]利用CM觀察發現，SS相關干眼的角結膜炎癥細胞密度較非SS相關干眼顯著增高。通過CM測量的角膜背向散射已被證明是評估不同臨床情況下角膜炎癥的有效參數[41-42]。Lanza等[43]報道，原發性干燥綜合征相關干眼患者的角膜背向散射較健康對照組顯著增高。這些研究均顯示SS相關干眼存在更高水平的眼表炎癥。

3.3慢性移植物抗宿主病同種異體造血干細胞移植(hematopoietic stem cell tansplantation, HSCT)后，30%～70%的患者發生慢性移植物抗宿主病(chronic graft-vs-host disease, cGVHD)[44]，其中60%～90%累及眼睛[45]。cGVHD眼部病變表現多樣，最常見的形式是干眼，發生率為40%～76%[45-46]。He等[47]利用CM觀察發現cGVHD相關干眼患者角膜緣上皮DC密度和中央角膜球狀免疫細胞密度顯著高于無GVHD的HSCT受者，顯示cGVHD相關干眼患者眼表面的免疫激活和炎癥程度較高，兩者可作為cGVHD相關干眼患者眼表損傷和炎癥嚴重程度的可靠指標。Kheirkhah等[48]道，CM下，cGVHD相關干眼的角結膜細胞變化與具有相同疾病嚴重程度的非GVHD相關干眼患者相似。Tepelus等[49]也觀察到兩者的CM表現沒有顯著差異。因此，cGVHD相關干眼的角結膜改變可能只代表了局部疾病嚴重程度。

綜上所述，CM以無創的方式將對角膜的觀察深入到微觀，提供更加客觀、真實的信息，在感染性角膜疾病、變性性角膜疾病及全身疾病所致角膜病變中具有獨特的應用價值。然而，隨著疾病研究的深入，CM應用越來越廣泛的同時，也顯現出一些不足：(1)操作相對復雜，學習曲線較長,需要患者良好的配合；(2)重復定位較難；(3)無法準確鑒別病原體及細胞等的種類，無法分辨細菌、病毒等體積更微小的病原體。未來，隨著技術進步，操作更簡便、定位更準確、分辨率更高的CM將具有更加廣闊的應用前景。