脈絡膜新生血管基因工程小鼠模型研究

徐曉瑋，黎 彪，邵 毅

0引言

脈絡膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)是許多影響視力的眼部疾病的主要病理特征，同時還與視網膜新生血管形成及二者吻合具有密切關系。CNV動物模型的發展有助于理解這些病癥的生物學特性，也可以用于測試新療法和發展新技術。雖然這些模型概括了CNV在人類中的許多臨床表現，但發展的時間、病程進展、病變的大小和外觀在不同的模型中各不相同。通常有三種動物模型CNV：激光誘導型、手術誘導模型和基因工程動物。對于前兩者的研究已經較為透徹，近年來隨著基因工程技術的快速發展，研發出多種不同基因工程動物模型。本綜述主要對幾種技術成熟、應用最為廣泛的基因工程動物模型CNV進行介紹。

1 CNV發病機制

CNV存在于許多脈絡膜視網膜疾病[1]，例如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、病理性高度近視和早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等[2]。理解CNV的病理生物學對于開發適合的動物模型非常重要。CNV代表對特定刺激的非特異性反應[3]。CNV的動態過程(起始、維持和退化階段)與血管生成、炎癥的動態過程和蛋白水解有關[4]。CNV的發展始于Bruch膜的破裂或缺陷，這可能繼發于創傷性損傷[5]、退行性病變[6]、組織牽引[7]和(或)炎癥[8]。CNV發病機制的關鍵包括巨噬細胞和視網膜色素上皮巨噬細胞，它們表達的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在該過程中起重要作用[9]。視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE)是脈絡膜新生血管形成過程的關鍵調節作用部位，它表達VEGF、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，調節單核細胞和內皮細胞募集[10]。VEGF是CNV中血管生成的主要引發劑[4]。由VEGF和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)介導的內皮細胞生長和包繞細胞外基質的周細胞覆蓋對于CNV形成是必需的[11]。CNV中涉及幾種炎癥因子系統，包括補體系統、細胞因子和趨化因子[12]。纖維蛋白充當CNV生長的支架[13]，纖維蛋白由循環纖維蛋白原從組織因子(tissue factor，TF)轉化而來。TF細胞受體是促進凝血酶和纖維蛋白兩者的絲氨酸蛋白酶的共活化劑。TF也參與炎癥、VEGF分泌和細胞黏附[14]過程，需要注意的是：脈絡膜新生血管可穿過Bruch膜破口，在視網膜下形成異常新生血管，且二者可以相互吻合[15]。

除了概括人類CNV的病理生物學之外，CNV的動物模型最好能夠具備在一定時間內有效且可重復，穩定且可持續，表現出類似人類CNV的包括生長模式在內的病理學特點[3]，生產便宜并能夠在體內使用包括熒光素血管造影術(fluorescein angiography，FFA)和光相干斷層掃描術(optical coherence tomography，OCT)的成像技術。以下主要介紹CNV基因工程小鼠模型，總結不同基因工程小鼠CNV模型的相關特征，并給出具體的例子，包括它們的優點和缺點。這些模型可以通過引入細胞因子、年齡、飲食和其他因素進行修改。

2 CNV基因工程小鼠模型及其特征

2.1 VEGF164RPE65轉基因小鼠雖然有幾種ARMD的轉基因小鼠模型，但只有相對較少的模型自發形成CNV。很明顯，視網膜VEGF或RPE過度表達不足以在這些模型中引起CNV，并且受損的Bruch膜在CNV發展中具有關鍵作用。該模型的優點是能夠通過比較對照和雜交育種實驗來研究CNV的各種生物組分。缺點是CNV發展的時長相對較長，發生CNV眼睛的比例相對較小和CNV面積小。該模型支持CNV的最佳模型是引入Bruch膜物理破壞的概念[16]。Schwesinger等[17]描述了一種轉基因小鼠表達由RPE65啟動子驅動的VEGF。所有的小鼠都形成了組織學上鑒定的脈絡膜內血管異常，未突破Bruch膜，被描述為脈絡膜新生血管樣改變(intrachoroidal neovascularization)，但最終未形成CNV。一些研究者認為該模型中的脈絡膜血管異常代表發育(血管發生)改變，而不是新生血管形成。

2.2 Tet/VMD2/VEGF和Tet/VMD2/VEGF/Ang2多重轉基因小鼠在一組實驗中，Oshima等[18]研究了雙重(Tet/VMD2/VEGF)和三重(Tet/VMD2/VEGF/Ang2)轉基因小鼠。RPE中VEGF表達增加的成年小鼠具有正常的視網膜和脈絡膜，并且不發生CNV。然而，視網膜下注射含有Ang2序列的腺病毒載體導致100%的Tet/VMD2/VEGF小鼠中產生組織學鑒定的CNV，而Tet/VMD2/VEGF/Ang2三重轉基因小鼠不自發產生CNV。研究人員使用免疫組化和熒光素葡聚糖灌注平臺來證明CNV的存在和大小。該模型提供了VEGF過度表達不足以發展CNV的重要信息；必須有Bruch膜水平的機械損傷和/或其他因素來誘導CNV。在轉基因動物中外源性施用四環素或多西環素可抑制目的基因的表達從而影響CNV的發生。需要注意的一點是，應該仔細評估多西環素下調CNV的動物模型。

2.3 Ccr2/Ccl2缺陷小鼠由Ambati等[19]研發的ARMD的Ccr2/Ccl2缺陷小鼠模型已經受到關注。在該模型中，Ccl2或Ccr2缺陷的轉基因小鼠不能將巨噬細胞募集到RPE和Bruch膜的區域，導致C5a和IgG的積累，二者均誘導VEGF產生。這些轉基因小鼠的組織學、免疫熒光和超微結構(電鏡)檢查顯示，大約25%的小鼠產生了顯微鏡下可見的CNV。這些發現有助于理解CNV的病理生物學，特別是巨噬細胞募集。雖然CNV的面積非常小，但最近的研究表明CCR3在這些缺陷小鼠CNV內皮細胞中特異性表達。CCR3靶向量子點的體內成像定位了不能通過傳統FFA發現的CNV[20]。這是CNV動物模型如何轉化為成像和治療人類CNV的一個很好的例子。

2.4 ApoE過表達小鼠Dithmar等[21]證實了高膽固醇血癥小鼠中Bruch膜和RPE區域中的ARMD樣改變。Malek等[22]對ApoE4過度表達的轉基因小鼠飼喂高脂肪膽固醇飲食，在65～127wk時除了觀察到玻璃疣樣和基底層狀樣沉積之外，還發展出CNV。并通過熒光素血管造影、組織學、免疫組織化學和電子顯微鏡檢查發現19%的雄性和18%的雌性小鼠發生CNV。該模型是研究ARMD樣病變中自發性CNV形成機制的重要模型。

2.5 Ccl2/Cx3cr1缺陷小鼠Chan等[23]研發了一種Ccl2/Cx3cr1缺陷雙敲除(deficient double knockout，DKE)轉基因小鼠，在RPE中N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanomalmine，A2E)水平升高，內質網蛋-29(endoplasmic reticulum protein-29，ERp29)水平降低。這些小鼠飼喂低ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，PUFAs)飲食時，出現了眼底和組織學超微結構可見的RPE變化和玻璃膜疣樣病變。該小鼠中的損傷在6wk內發生，在轉基因小鼠中時間跨度短，因此成為轉基因小鼠自發性新生血管形成中具有潛在吸引力的模型。

2.6 SOD1-/-老化小鼠Imamura等[24]研究了Cu-Zn-超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD1)缺陷小鼠的視網膜、RPE、Bruch膜和脈絡膜區域的眼底、FA、組織學、超微結構和免疫組織化學特征發現，這些SOD1-/-老化小鼠分別有8.3%和10%存在CNV的眼底和組織學證據。在老化SOD1-/-小鼠的RPE中檢測到氧化損傷DNA的標志物8-羥基-2’-2-脫氧鳥苷(I-OHdG)，但在對照中未檢測到。相對于12月齡的小鼠而言，16月齡小鼠的視網膜血管與脈絡膜下新生血管相吻合。

2.7 Vldlr-/-定向突變小鼠該小鼠為針對極低密度脂蛋白受體基因(VldlrTm1Her)的靶向突變的純合子小鼠。3mo后小鼠在視網膜外叢狀層和脈絡膜吻合區域形成新的血管[25]。如后文提及的自發性16號染色體Bst突變小鼠一樣，這些特征似乎與視網膜血管瘤性增生病變(retinal angiomatous hyperplasia，RAP)相似。

2.8視紫紅質啟動子/VEGF過度表達小鼠Okamoto等[26]和Tobe等[27]研發了視紫紅質啟動子/VEGF融合基因轉基因小鼠。這些小鼠的后代與C57BL/6小鼠雜交發展成FFA可見的視網膜內新生血管形成，延伸到視網膜下。該損傷與RAP相似，表明VEGF在視網膜中的過度表達足以引起視網膜內和視網膜下新生血管生成。新生血管形成可能起源于動物的脈絡膜和視網膜，從而導致脈絡膜-視網膜吻合。該小鼠模型可以用于評估新的CNV治療方法。

2.9自發性16號染色體Bst突變小鼠Smith等[28]已經深入研究了自發性16號染色體Bst基因突變小鼠的眼部組織病理學。眼底檢查發現，該小鼠自發形成了視網膜損傷。自發性腹部斑點和尾巴(Bst)突變出現在C57BLKS近交系小鼠中。通過眼底檢查、FFA和組織學研究，發現大約88%的小鼠發生組織學上確定的視網膜下新生血管。新生血管形成與RPE異常、視網膜錯構瘤樣病變以及Bruch膜缺陷引起的視網膜和脈絡膜新生血管吻合有關。盡管新生血管形成與年齡有關，但在這種小鼠中沒有玻璃疣樣或基底層類沉積樣損傷，因此相比于ARMD中的CNV，新生血管的形成更類似于RAP。

2.10 Cp-/-Heph-/Y敲除小鼠Hahn等[29]證明在轉基因小鼠中，鐵質過氧化氫酶和輔助蛋白的破壞導致了鐵的過量。轉基因小鼠的血漿銅藍蛋白和膜鐵轉運蛋白輔助蛋白破壞導致鐵超載引起ARMD樣改變。這些小鼠產生RPE變化和光感受器變性。盡管脈絡膜和視網膜新生血管生成并不明顯，但小鼠在RPE水平發生明顯的病變，且100%的小鼠發生了組織學上確定的視網膜下新生血管。此外，這些小鼠不像ARMD那樣發展出玻璃疣狀或基底層狀(類)沉積樣病變。

3總結與展望

總之，成功的CNV動物模型所需的三個特征：(1)VEGF引起的持續性血管生成；(2)炎性細胞因子組分；(3)Bruch膜受損[30]。迄今為止的研究模型表明，VEGF過度表達不足以引起CNV的發展；需要以機械或生物學方式造成Bruch膜的損傷以誘導CNV。Bruch膜在人CNV的形成中起中心作用。所有模型都需要Bruch膜受損、VEGF表達和炎性細胞因子等因素介導。這也強調了在CNV形成中起主要作用的因素取決于模型。一些模型具有由視網膜或RPE特異性啟動子驅動的VEGF過度表達的轉基因動物過度表達VEGF。還有模型強調了巨噬細胞募集作用的關鍵性。利用CNV動物模型實驗時，研究者應該了解CNV形成中各種因素(如對Bruch膜的機械損傷、VEGF產生、炎性細胞因子介導)的相對重要性。沒有絕對理想的CNV動物模型，每種現有基因工程小鼠CNV模型都有優點和缺點。選擇動物模型時的注意事項與模型的用途有關。在決定使用哪種動物模型的CNV時，給定的實驗室的能力，包括預算、動物培養設施和實驗目標都非常重要。