慢性阻塞性肺疾病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

葉榮琛 嚴(yán)國(guó)林 楊伊霖 蔡嘉威 鐘臻蔚 朱瑩瑩 周玉民

1廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院511436;2廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室510120

COPD 是一種常見的,可以預(yù)防和治療的肺部疾病,其特點(diǎn)表現(xiàn)為持續(xù)的呼吸癥狀如咳嗽和呼吸困難以及氣流受限,其發(fā)病與吸煙或生命早期不良接觸史的協(xié)同作用以及有害顆粒或氣體引起的氣道和肺泡病變有關(guān)[1]。我國(guó)最新的大規(guī)模COPD 流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國(guó)COPD 患者人數(shù)約達(dá)一億人,20歲及以上成人的COPD 患病率為8.6%,40 歲以上則達(dá)13.7%,60 歲以上人群患病率已超過27%[2]。COPD 發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響,目前研究較多的發(fā)病機(jī)制包括慢性炎癥反應(yīng)、蛋白酶抗蛋白酶失衡、免疫反應(yīng)失調(diào)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等。作為臨床前疾病機(jī)制研究的重要途徑,建立COPD 疾病動(dòng)物模型是COPD 各類研究工作的基礎(chǔ)。近幾年隨著COPD 發(fā)病機(jī)制研究及進(jìn)展的深入,出現(xiàn)了多種新的COPD 動(dòng)物模型的構(gòu)建方式,我們就當(dāng)前COPD 動(dòng)物模型的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 COPD造模動(dòng)物的選擇

目前已有許多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被應(yīng)用于COPD 動(dòng)物模型的造模中,包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、豬及其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇,實(shí)驗(yàn)者主要從解剖結(jié)構(gòu)、病理變化、可行性及經(jīng)濟(jì)方面進(jìn)行考慮。目前應(yīng)用較多的為鼠類,常見的小鼠COPD 品系包括C57BL/6、BALB/c和A/J小鼠等,其優(yōu)缺點(diǎn)如下。

小鼠COPD 模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)已經(jīng)具有明確的小鼠基因信息,且其與人類基因組接近,僅有約300個(gè)基因不同；(2)實(shí)驗(yàn)用抗體種類豐富； (3)小鼠品系繁多,且不同品系對(duì)煙草煙霧的反應(yīng)存在差異,可供不同需要進(jìn)行選擇[3]；(4)易于制備轉(zhuǎn)基因小鼠；(5)近交系小鼠的應(yīng)用消除了遺傳變異的問題；(6)小鼠繁殖周期短,數(shù)量多,實(shí)驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)較低。但小鼠也存在相應(yīng)缺點(diǎn)： (1)小鼠呼吸系統(tǒng)和人類之間存在明顯的生理學(xué)差異,如小鼠氣道幾乎沒有黏膜下腺,導(dǎo)致其不能引起黏液高分泌的病理變化；(2)小鼠擁有不同于人類分叉狀的單軸氣道分支模式,其支氣管分支數(shù)量與人類相比也大大減少[4]；(3)人與小鼠的免疫系統(tǒng)有較大的差別；(4)小鼠并不總是表達(dá)與人類相同的蛋白質(zhì)。大鼠的優(yōu)缺點(diǎn)與小鼠相似[5]。除鼠類以外,有些研究選用豬、羊或靈長(zhǎng)類動(dòng)物,這一類動(dòng)物無論是在解剖結(jié)構(gòu)亦或是病理變化上都與人類更為接近,但由于其飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)成本高,且因涉及倫理問題而無法大批量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),故應(yīng)用范圍較為局限。

2 常見造模方法及模型評(píng)價(jià)

2.1 氣道吸入

2.1.1 香煙煙霧暴露 吸煙是目前COPD 最常見的病因,香煙煙霧暴露模型能復(fù)制多種COPD 病理生理改變,包括肺氣腫樣改變、氣道慢性炎癥、氣道重塑、氧化應(yīng)激、血管重塑及肺動(dòng)脈高壓等。Liu等[6]將雄性SD 大鼠全身暴露于香煙煙霧中,每次10支香煙,每天2次,持續(xù)4個(gè)月造模成功。然而全身暴露于香煙煙霧中可能使尼古丁等煙草有害物質(zhì)通過動(dòng)物皮膚黏膜或在動(dòng)物整理皮毛時(shí)進(jìn)入體內(nèi)[7],因此單純口鼻暴露于香煙煙霧較全身暴露更符合人類吸煙行為習(xí)慣。Shu等[8]通過比較全身暴露及口鼻暴露2種COPD 小鼠模型建立方法發(fā)現(xiàn),僅采用口鼻暴露可以減少小鼠因皮膚煙霧殘留出現(xiàn)的瘙癢、不適、戰(zhàn)斗等行為,且在口鼻暴露模型中,小鼠的煙霧吸入量可以更準(zhǔn)確地控制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更易重復(fù)。香煙煙霧暴露模型通過全身暴露或口鼻暴露模擬人類吸煙過程,可復(fù)制多種人類COPD 病理改變,是較為理想的模型。但香煙暴露模型一般造模時(shí)間較長(zhǎng),普遍在數(shù)個(gè)月至半年以上,造模過程耗費(fèi)較多人力物力。香煙煙霧暴露患者在停止暴露后病理生理變化仍有進(jìn)展加重,但動(dòng)物模型停止香煙煙霧刺激后病理生理改變是否進(jìn)展仍存在爭(zhēng)議,需要進(jìn)一步探究[9]。

2.1.2 可吸入顆粒物質(zhì) (particulate matter,PM)暴露PM 是空氣污染中的主要成分,而PM2.5被認(rèn)為在COPD的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用。已有研究證明,隨著PM 的直徑減小,其穿透小氣道并進(jìn)入體循環(huán)的能力增強(qiáng)[10]。近年來,研究表明空氣污染與COPD 的發(fā)病及疾病進(jìn)展有密切關(guān)系[11]。最近的研究主要集中在兩大空氣污染源,即生物質(zhì)燃料和機(jī)動(dòng)車尾氣[12]。He等[13]將64只雌性SD 大鼠分別暴露在生物質(zhì)燃料、機(jī)動(dòng)車尾氣污染空氣的PM 中,每天4次,每次1 h,每周5 d,持續(xù)7 個(gè)月,成功建造COPD 動(dòng)物模型,其呼吸系統(tǒng)病理改變與人類COPD 患者病理變化一致,包括肺部炎癥,肺氣腫,小氣道重塑,氣道黏液分泌過多,肺功能減退和全身性炎癥反應(yīng)。而王光艷等[14]將Wistar大鼠暴露在濃度為500μg/m2的PM2.5中,為期3個(gè)月,同樣成功構(gòu)建大鼠肺氣腫模型。污染空氣PM 暴露的動(dòng)物模型較好地模擬了暴露于污染空氣的人類COPD 患者的過程及病理變化。但該模型制作時(shí)間較長(zhǎng),且目前PM 的制作過程繁瑣,制作方式多樣,難以控制PM 中各成分比例,也未能控制其他可能誘導(dǎo)COPD 的有害氣體的濃度,如二氧化硫 (sulfur dioxide,SO2)、二氧化氮 (nitrogen dioxide,NO2)等。

2.1.3 其他有害氣體暴露 除香煙煙霧及PM 以外,其他有害氣體如SO2、NO2和臭氧等也可用于COPD 動(dòng)物模型的構(gòu)建。Wiegman等[15]將雄性C57BL/6小鼠暴露在O3中長(zhǎng)達(dá)6周,成功制造COPD 小鼠模型。Wegmann等[16]將雄性C57BL/6小鼠暴露在吸入濃度為20 ppm 的NO2中,每天14 h,持續(xù)25 d,成功建造COPD 小鼠模型。Wagner等[17]將雄性SD 大鼠持續(xù)暴露在吸入濃度為20 ppm 的SO2中,持續(xù)25 d,成功建造COPD 大鼠模型,其病理改變符合COPD 樣改變,此外還存在黏液分泌增多的特征性改變。

2.2 氣管注射

2.2.1 氣管滴注蛋白酶 蛋白酶-抗蛋白酶失衡學(xué)說是COPD 的重要發(fā)病機(jī)制,吸煙、氧化應(yīng)激、有害氣體或有毒物質(zhì)可引起蛋白水解酶的增多或抗蛋白酶的不足。通過氣管內(nèi)滴注蛋白水解酶能復(fù)制出肺氣腫模型,而常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以及人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。Tibboel等[18]通過向C57BL/6 小鼠氣管內(nèi)滴注4.8單位/100 g的豬胰蛋白酶,成功造出肺氣腫模型。毛旻等[19]通過向小型豬氣管內(nèi)注入6 單位/kg木瓜蛋白酶,每周1次,持續(xù)5周,成功誘導(dǎo)COPD。氣管內(nèi)滴注蛋白酶具有感染少、操作簡(jiǎn)便、注藥劑量易掌握、造模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。但酶的種類、劑量以及動(dòng)物的品種、年齡對(duì)造模結(jié)果影響巨大,需要統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)及嚴(yán)格控制。且此類動(dòng)物模型容易誘導(dǎo)嚴(yán)重的肺氣腫病變,但與人類常見的由于長(zhǎng)期煙霧暴露慢性刺激引起的致病過程與病理變化不完全一致。

2.2.2 氣管注射致病菌及菌液成分 除了氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶,也可通過注射致病菌或菌液成分誘導(dǎo)COPD。在氣 道 中 病 菌 通 過 不 斷 繁 殖 并 釋 放 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖和多種酶刺激氣道產(chǎn)生的慢性炎癥反應(yīng),造成氣道的損傷,從而實(shí)現(xiàn)其致病作用。許滸等[20]將Wistar大鼠注入肺炎克雷伯桿菌液0.1 ml,每周2次,持續(xù)2個(gè)月,成功制造具有COPD 病理學(xué)特征的動(dòng)物模型。此外,氣管內(nèi)滴注LPS也可用于制作COPD 動(dòng)物模型。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分,可以刺激單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞合成釋放大量炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-1β、破壞蛋白酶-抗蛋白酶平衡,介導(dǎo)呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。Vernooy等[21]將雄性Swiss小鼠氣管內(nèi)滴注LPS,每次5μg,每周2次,持續(xù)12周,成功制作出COPD 小鼠模型。上述模型具有造模時(shí)間較短,操作方便等優(yōu)點(diǎn),且Sethi 和Murphy[22]的研究認(rèn)為細(xì)菌感染可能是COPD 重要的致病因素,氣管內(nèi)注射細(xì)菌致COPD 動(dòng)物模型模擬了這一發(fā)病過程。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,此類COPD 動(dòng)物模型可為后續(xù)研究提供方法學(xué)支持。

2.3 腹腔注射

2.3.1 腹腔注射香煙煙霧提取物 使用香煙煙霧提取物誘導(dǎo)COPD 動(dòng)物模型也是一種常用的造模方法。Chen等[23]通過點(diǎn)燃香煙,將煙霧過濾去除顆粒物和細(xì)菌后裝入含有PBS (1 ml/支)中制成CSE-PBS溶液,并使用6周齡雄性SD 大鼠,在第1、8、15天分別腹腔內(nèi)注射1 ml CSE-PBS溶液,在3 周內(nèi)成功誘導(dǎo)出肺氣腫大鼠模型。CSE 誘導(dǎo)COPD 動(dòng)物模型造模時(shí)間短,操作簡(jiǎn)單,病理生理變化與人類COPD 接近,但容易受到CSE溶液成分及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種、年齡、給藥方式和時(shí)間等因素的影響。腹腔注射CSE誘導(dǎo)COPD 的作用機(jī)制和途徑尚不明確,可能使Th1細(xì)胞活化,炎癥因子增多,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白酶-抗蛋白酶失衡,造成氣道炎癥反應(yīng)及肺結(jié)構(gòu)破壞,需要進(jìn)一步的探究[24]。

2.3.2 腹腔注射內(nèi)皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)受體阻斷劑 近年來,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是重要的COPD 發(fā)病機(jī)制之一。劉紹坤等[25]報(bào)道在COPD 動(dòng)物模型及患者身上發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均升高且呈正相關(guān),肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可引起肺泡間隔結(jié)構(gòu)破壞消失,進(jìn)而引起肺氣腫。而成人肺中可產(chǎn)生大量的VEGF 蛋白,通過與其受體相結(jié)合而發(fā)揮促內(nèi)皮細(xì)胞存活和抗凋亡的功能。Kasahara等[26]通過在雄性SD 大鼠皮下注射VEGF受體阻滯劑SU5416,直接導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮凋亡,成功在3周后觀察到大鼠肺泡間隔細(xì)胞凋亡,其病理改變符合肺氣腫模型。Taraseviciene-Stewart等[27]將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞腹腔注射于免疫功能正常的SD 大鼠,3周后檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞抗體,且有肺泡間隔細(xì)胞凋亡等肺氣腫樣病理改變,成功建立自身免疫性肺氣腫模型。細(xì)胞凋亡模型的特點(diǎn)在于肺組織中無明顯炎細(xì)胞聚集等炎癥表現(xiàn),僅有肺泡腔擴(kuò)大、血管重塑等變化,無明顯氣道病理改變,不完全符合COPD 患者病理變化,其作用機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。

2.4 基因工程技術(shù) 除上述傳統(tǒng)COPD 動(dòng)物模型,基因相關(guān)的肺氣腫動(dòng)物模型也是近年來的研究熱點(diǎn)。部分研究使用了不同品系的基因突變小鼠,這些小鼠抗氧化能力及抗蛋白酶表達(dá)水平不同,且對(duì)煙霧的炎癥反應(yīng)也存在差異,因此對(duì)香煙煙霧暴露存在不同的反應(yīng)[28]。基因工程小鼠也可通過基因敲除滅活VEGF基因,使肺部VEGF及VEGF受體2表達(dá)水平大幅下降,誘導(dǎo)出肺氣腫樣病理變化[29]。某些特定基因的組成性過度表達(dá)同樣可以導(dǎo)致肺部異常發(fā)育,如IL-13和干擾素-γ的過度表達(dá),可引起炎癥反應(yīng)及肺泡腔擴(kuò)大等病理表現(xiàn)[30-31]。但基因的組成性表達(dá)會(huì)加速動(dòng)物衰老,從而導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生[32]。基因工程動(dòng)物模型不符合人類COPD 患者的自然發(fā)病過程,不適合用于探究人類COPD 發(fā)病機(jī)制,且大量過表達(dá)的蛋白質(zhì)也可能發(fā)揮與生理劑量不同的生理作用,在研究中需要考慮到這一點(diǎn)[28]。但此類模型可為進(jìn)一步探究某些基因在COPD 發(fā)病過程中的作用提供支持。

2.5 多因素聯(lián)合模型 人類COPD 患者的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,單一的造模方法難以模擬人類COPD 的病理變化和臨床特征。建立標(biāo)準(zhǔn)化、符合臨床實(shí)際的COPD 動(dòng)物模型一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的難題,使用聯(lián)合刺激方法構(gòu)建COPD 動(dòng)物模型不僅較好地還原人類COPD 的病理變化,且相比單一因素刺激更加節(jié)約時(shí)間和人力,同時(shí)也能在COPD 的基礎(chǔ)上構(gòu)建相關(guān)并發(fā)癥或急性加重模型。余常輝等[33]通過對(duì)比單純煙熏和煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注LPS兩種方法誘導(dǎo)原發(fā)性高血壓大鼠慢性肺阻塞模型,觀察到煙熏聯(lián)合LPS組較單純煙熏組表現(xiàn)出更明顯的氣道炎癥、肺氣腫及氣道阻力增加,并且肺組織核因子κB信號(hào)通路激活、下游炎癥瀑式反應(yīng)及SP-A 減少都較明顯,證實(shí)煙熏聯(lián)合LPS組建立的高血壓大鼠COPD 模型能更好的模擬人類慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫的形態(tài)學(xué)、功能學(xué)以及病理生理學(xué)改變。

3 模型評(píng)價(jià)

3.1 肺功能檢測(cè) 肺功能檢測(cè)對(duì)于研究動(dòng)物呼吸生理功能的基本狀況特別是判斷是否出現(xiàn)氣流受限具有重要的意義。有創(chuàng)肺功能檢測(cè)主要具有敏感性和特異性高、可排除上氣道阻力的影響等優(yōu)點(diǎn),但由于具有有創(chuàng)性與實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性,其不能重復(fù)測(cè)量及實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)的特點(diǎn)也較為顯著。相比之下,無創(chuàng)方法具有對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷小,因而允許在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量且方法方便快捷的特點(diǎn),故多用于需要重復(fù)測(cè)量且動(dòng)物量較大的研究[34]。無創(chuàng)方法主要為體積描記法及強(qiáng)迫振蕩肺功能技術(shù)[35]。常用的肺功能檢測(cè)指標(biāo)有呼氣峰流速、潮氣量、每分鐘通氣量、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性、吸氣阻力、呼氣阻力、氣道阻力、用力呼氣容積、用力肺活量以及兩者的比值等。其中不同實(shí)驗(yàn)對(duì)FVC的測(cè)定時(shí)間的選擇有所不同,常見的有0.05 s、0.1 s、0.2 s及0.3 s。

3.2 病理學(xué)檢查 病理學(xué)檢查通過將新鮮氣道及肺實(shí)質(zhì)組織置于固定液中進(jìn)行固定,并進(jìn)行石蠟包埋、切片,行HE 染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察,從而判斷其病理變化是否符合COPD 樣改變。用于評(píng)估氣道病理改變的指標(biāo)有：炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)并通過半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)其炎癥程度進(jìn)行分級(jí)；通過Masson 染色評(píng)估膠原沉積程度；通過AB-PAS染色檢測(cè)黏多糖分泌情況；支氣管壁厚度/直徑以及平滑肌細(xì)胞橫截面積等。而評(píng)估肺氣腫病理改變的常用指標(biāo)包括平均線性截距、肺泡平均截距、平均肺泡數(shù)量、肺泡比例以及肺泡破壞指數(shù)。

3.3 炎癥細(xì)胞及介質(zhì)檢測(cè) 除上述肺功能及病理學(xué)檢測(cè)外,支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血清中炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)水平也可作為COPD動(dòng)物模型判定標(biāo)準(zhǔn)之一。BALF 制取過程常通過對(duì)全麻動(dòng)物模型進(jìn)行氣管插管,選擇生理鹽水或緩沖液,行單側(cè)或雙側(cè)肺泡灌洗并留取BALF,BALF 常溫離心后所得的細(xì)胞成分可用于細(xì)胞計(jì)數(shù)分析,所得上層清液可用于炎癥介質(zhì)等指標(biāo)的測(cè)定。

3.4 其他指標(biāo) 除了上述評(píng)價(jià)指標(biāo),氧化應(yīng)激、蛋白酶及抗蛋白酶指標(biāo)也可用于評(píng)價(jià)COPD 動(dòng)物模型。在COPD 動(dòng)物模型中常測(cè)的氧化應(yīng)激指標(biāo)包括丙二醛以及過氧化物酶、超氧化物歧化酶和一氧化氮等[36]。其中丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化可反映肺受自由基攻擊,脂質(zhì)過氧化的程度。超氧化物歧化酶是需氧代謝細(xì)胞中的自由基清除劑,其活力可反映機(jī)體清除自由基的能力。由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)蛋白金屬酶 (matrix metalloproteinase,MMPs)、金屬蛋白酶抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)、抗胰蛋白酶等為蛋白酶/抗蛋白酶中的主要成員[37],可通過免疫組織化學(xué)法來檢測(cè)它們的表達(dá)。MMPs是降解氣道細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要蛋白酶類,在研究中多以MMP-9 為重。已發(fā)現(xiàn)的TIMPs均由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生,其為MMPs特異的組織抑制因子,兩者的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)和呼吸道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有重要的意義,其中以研究TIMP-1多見。

4 總結(jié)與展望

人類COPD 具有復(fù)雜的病因及發(fā)病機(jī)制,目前尚無一種COPD 動(dòng)物模型可以完全模擬人類COPD 所有特征,大部分動(dòng)物模型主要模擬其中一種發(fā)病機(jī)制。煙草煙霧暴露模型可模擬相對(duì)較復(fù)雜的病理改變,且較好地模擬了人類COPD的致病過程,是目前最常見且較為理想的動(dòng)物模型。近年來,隨著COPD 流行病學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)除香煙煙霧以外,生物質(zhì)燃料及機(jī)動(dòng)車尾氣相關(guān)污染空氣也是COPD 重要致病因素之一。因此,使用污染空氣PM 構(gòu)建COPD 動(dòng)物模型成為一種可行的新興建模方法。隨著COPD 動(dòng)物模型的發(fā)展,將會(huì)出現(xiàn)能更好地模擬人類COPD 致病機(jī)制及病理生理改變的動(dòng)物模型,使我們對(duì)COPD 的病因及疾病發(fā)展過程有更深入的理解。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突