創傷膿毒癥早期預警診斷生物標志物的研究進展

向桂霖,伍秋菊,張安強

在戰爭、地震、海嘯和泥石流等重大災難發生時感染仍是困擾戰創傷救治的棘手難題。在創傷所造成的患者死亡中，其中3/5發生在創傷現場與急救過程中，而2/5發生在患者住院期間，主要是由感染和器官功能障礙引起的[1]。傷員經歷創傷打擊造成的初始損傷及手術等處置措施導致機體炎癥-抗炎反應平衡被打破，一方面會引起器官器質性損傷，另一方面也會增加膿毒癥及相關并發癥(臟器功能障礙)的發生風險。盡管早期的液體復蘇、新型抗生素治療、代謝支持及重要臟器功能支持治療取得了顯著進展，創傷即刻的病死率明顯下降，但院內感染發生率仍高達20%～30%，是傷殘和后期死亡的重要原因，而膿毒癥是主要死因(占70%以上)，成為進一步提升創傷救治成功率的最大障礙[2]。因此早期發現及精準治療可有效降低創傷膿毒癥的發生及改善患者的預后。然而，病原體的診斷需要細菌培養，且耗時較長，對傷員感染的發現及臨床診療決策產生延誤；況且部分傷員即使發生感染，其細菌培養可呈陰性，仍無法進行早期診斷，這也是導致創傷膿毒癥高發生率及高病死率的主要原因。如能對創傷膿毒癥的發生進行盡早預測，并對高危傷員進行早期精準干預，則能降低膿毒癥及其不良結局(膿毒性休克、多器官功能障礙)的發生，降低傷員病死率。現有針對創傷膿毒癥早期預警診斷方法的研究大致可以分為傷員人口學資料、創傷嚴重度評分系統(AIS、ISS、NISS等)、生理和生化指標、機體遺傳背景等幾個方面。本文對已開展的創傷膿毒癥預警診斷生物標志物研究進展進行綜述，為創傷膿毒癥預警診斷生物標志物的開發和臨床應用提供思路。

1 傷病員人口學信息

大量臨床流行病學調查和動物實驗證明傷病員的年齡、性別、損傷嚴重程度等與傷后膿毒癥的發生風險密切相關，即隨著傷員年齡和損傷嚴重程度的增加，膿毒癥發生風險顯著增加；男性傷員較女性傷員更容易發生膿毒癥[3]。動物實驗研究也證實雄性和切除卵巢的雌性小鼠免疫功能被削弱，雌激素能夠增強免疫功能和心血管保護，維持機體免疫應答的功能[4]。然而這些已被證實的危險因素在單獨預測創傷膿毒癥發生風險時的特異性和敏感性有待進一步檢驗和確認；但其仍可以作為危險因子加入聯合預警中發揮作用[5]。

2 血漿生物標志物

創傷會引起機體一系列病理生理學和生物學指標的變化，這些指標的改變可能提示或參與組織損傷、細菌感染及炎癥反應。理想的血漿生理學和生物學指標應該具有較早、較高的靈敏度以助于早期診斷，同時應該具有一定的特異性以指導及時正確的治療。近年來不斷有新的血漿生物標志物被發現用于創傷膿毒癥的早期預測，其中個別血漿標志物已應用于臨床診療過程中。

臨床較早使用的炎癥反應監控指標是血漿C反應蛋白(CRP)，屬于非特異性急性期時相蛋白，是對炎癥或組織損傷極其敏感的生物標志物，在機體發生感染、手術或創傷后4～6h內逐漸升高，8h左右增加1倍，36～50h達高峰，其半衰期較短(4～7h)。當機體發生炎癥反應時，CRP在血漿中的濃度會迅速升高，又因其半衰期較短，當炎癥消失時其濃度也會隨之快速降低，并且其在臨床上的檢測費用相對較低，已被大規模開展。但其無法區分感染性炎癥和非感染性炎癥，在創傷時即有顯著升高，故其對創傷膿毒癥的診斷價值有限，需要結合其他指標綜合應用[6-7]。

血漿降鈣素原(procalcitonin，PCT)現已被證明可作為細菌感染及膿毒癥發生的生物標志物，當發生細菌感染時，PCT會從甲狀腺外的全身多種細胞中釋放入血，在細菌內毒素及各種促炎因子如腫瘤壞死因子、白細胞介素等的刺激下，在感染開始后的最初3h即可測得，6～12h可達到高峰，與傳統的生物標志物相比，半衰期接近24h，且不受腎功能狀態、激素治療的影響。在細菌感染引起的膿毒癥時，PCT的敏感度和特異度均優于CRP。PCT不僅可以用來區分細菌感染和病毒感染，甚至可以用來鑒別革蘭陽性菌感染、革蘭陰性菌感染或真菌感染。此外動態監測PCT水平有助于創傷后膿毒癥的早期診斷、評估嚴重程度、指導抗生素治療、判斷預后結果，其臨床意義已經得到了廣泛的認可和應用[6,8]。

另一個是機體糖代謝產物血乳酸，其水平高低主要用于診斷和評估嚴重膿毒癥和膿毒癥休克。血乳酸水平與病情嚴重程度、疾病預后密切相關，是嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者預后的獨立影響因素之一。嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者液體復蘇過程中，血乳酸和乳酸清除率檢測可作為判斷預后的指標。臨床檢測血乳酸水平主要用于監測是否發生膿毒癥和組織低灌注程度[6]。

IL-6是由T/B淋巴細胞、內皮細胞等多種細胞合成的糖蛋白。TNF-α和IL-1β等細胞因子或病毒或細菌成分脂多糖(LPS)等均可以誘導IL-6產生。IL-6可以誘導肝細胞合成CRP、纖維蛋白原、α1抗胰蛋白酶和補體因子等急性期反應蛋白，促進細胞毒性T細胞的分化以及增強自然殺傷細胞的活性。當機體遭受感染或組織損傷時可以激發機體循環IL-6的釋放，并且可以在短短2h內達到高峰，進而參與到各種炎癥反應和抗炎反應中。針對IL-6在預測創傷膿毒癥發生風險的效能方面，現有研究尚存在爭議[6]。有部分研究認為，IL-6可以辨別易患膿毒癥的高危創傷傷員；而另有研究也顯示，IL-6的濃度與傷員是否發生膿毒癥并無關聯。現臨床IL-6檢測主要用于監測炎癥反應程度和創傷并發癥發生情況，當創傷后IL-6迅速升高并迅速回歸基線提示傷病員發生并發癥風險低。盡管在感染或其他刺激后IL-6能夠快速表達，是其作為生物標志物的突出特性，但是IL-6檢測有明顯的局限性，許多非感染因素如手術、移植排斥及多發傷等也可引起血漿IL-6升高。因此，將IL-6作為常規炎性標志物應用于創傷膿毒癥的預警診斷還需要更確切的研究佐證。

除了上述在臨床已被應用的血漿生物標志物外，也發現一些新的有望成為創傷膿毒癥血漿生物標志物，如硫氧還原蛋白(Thioredoxin)[9]、白介素17(IL-17)[10]、可溶性白介素2受體α鏈(sIL-2Rα)[11]、可溶性髓系細胞觸發受體1(sTREM-1)[11]、可溶性尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物受體(suPAR)[12]、氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)[13]、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)[14]和可溶性脂肪酸合成酶(sFas)[15]等。然而這些研究大多局限在小樣本、單個研究人群，其敏感性和特異性有限，缺乏大樣本、多中心前瞻性研究和臨床驗證(表1)。

表1 新發現的創傷膿毒癥血漿生物標志物研究概況

0d表示入院24h內

3 細胞生物標志物

CD64作為一種高親和力免疫球蛋白Fc片段受體，正常情況下持續表達于單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面，而中性粒細胞表面幾乎不表達。當感染發生時，體內中性粒細胞活化，4～6h后其表面CD64表達逐漸升高，24h左右達到峰值。當刺激因素去除后，中性粒細胞表面CD64在48h內迅速下降，7d左右恢復正常水平。應用流式細胞計數檢測CD64是常用的方法，具有簡單、快速、準確等優點，非常適合臨床檢驗使用，其早期診斷膿毒癥的敏感度和特異度分別為75%和86%，對細菌感染的早期診斷、評估預后及用藥療效等方面具有重要的臨床價值[16]。

人白細胞DR抗原(HLA-DR)是MHCII分子中的一員，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞和B淋巴細胞等各種抗原呈遞細胞表面。循環血中CD14+單核細胞內HLA-DR的低表達被認為是機體存在免疫抑制狀態的標志。有研究證實[17-18]，CD14+單核細胞HLA-DR下降與創傷后免疫抑制所致的感染有關。嚴重創傷后單核細胞HLA-DR的低表達可以作為預測膿毒癥發生風險的免疫功能指標。

4 遺傳生物標志物

基因不僅是機體遺傳信息的載體，也是決定生老病死等生命活動的物質基礎。基因序列上的堿基變異，即基因多態性是導致人類體征差異、疾病易感性、嚴重程度及預后和藥物治療反應差異性的重要原因。創傷本身雖然與機體遺傳背景無關，但創傷引發的機體反應，特別是決定膿毒癥和器官功能障礙發生的全身炎癥反應，卻與遺傳背景密切關聯。個體間遺傳背景的差異性是決定創傷膿毒癥易患性和預后的重要因素。正因如此，近年來，人們開始從遺傳背景上探尋影響創傷膿毒癥風險性的基因多態性生物標志物[19]。包括課題組在內的創傷膿毒癥基因多態性研究已涉及的基因有模式識別受體(TLRs、CD14、MD2、LBP、NLRPs、MBL、FCGR、RAGE、FPR)、轉錄因子(NFKB、PPAR)、炎癥因子(IL、TNF、HMGB1)、調控分子(microRNA、ND1)等。研究逐漸發現了一些可能影響創傷膿毒癥發生風險的高危基因多態性位點(表2)，其基因型檢測可能為創傷膿毒癥的早期預警診斷和開展個體化治療提供判斷依據。

表2 研究發現的創傷膿毒癥高危基因多態性位點研究概況

然而這些研究也存在以下局限性：(1)高危遺傳生物標志物的評估方法大多采用與疾病風險性發生高低的關聯度OR值進行闡述，且統計學界定P值不嚴格，但OR值并不能反映個體水平的風險性，還應進行如靈敏度、特異度等診斷實驗方面的評估，才能說明其是否是一個合格有效的生物標志物;(2)大多研究未制定規范化統一的研究設計方案，臨床研究本就影響因素較多且不易受人為控制，如在試驗前不制定明確統一的標準如疾病表型的界定、研究人群的納入排除標準、臨床資料采集的代表性等，勢必會導致選擇性偏倚和研究結果的準確性;(3)研究人群個數和樣本量普遍偏小，且缺乏多中心重復驗證，按照統計學要求大多數研究僅有幾十至幾百例，樣本并未達到公認的強度;(4)研究過程普遍缺乏質量控制，如生物樣本采集、處理和保存的規范化，檢測方法的準確性和檢測試劑的標準化，研究人群的雙/三盲性等。故這部分生物標志物的研究仍需在嚴格規范的研究方案指導下進行大樣本、多中心重復和驗證。

5 多種生物標志物聯合預警

創傷膿毒癥的發生，其機制往往涉及免疫炎癥反應、神經內分泌反應、心血管反應、細胞代謝反應等，是眾多因素相互作用的結果。單一生物標志物只能反映機體某一方面的變化，對疾病的甄別作用極為有限。而多個生物標志物聯合的創傷膿毒癥預警診斷研究較少[36,45,48-49]，僅有少數幾篇報道單個基因多態性組合形成的單倍型可能影響創傷膿毒癥發生風險，如IL-10啟動子區3個基因多態性位點的單倍型(-1082-819-592ATA)在小樣本人群(114例)中能夠影響創傷膿毒癥發生風險。在危重病人群[49]開展的血漿和細胞生物標志物的組合研究提示血漿PCT、sTREM-1和中性粒細胞CD64指數的組合在膿毒癥發生風險的預警診斷中優于單個指標。這也說明單個生物標志物在復雜疾病中的預警診斷價值有限，故需要開展血漿、細胞與遺傳生物標志物結合傷病員臨床流行病學信息的多指標聯合的創傷膿毒癥早期預警診斷研究。

6 展望

若能盡早對創傷膿毒癥的發生進行預測并對高危傷員進行有針對性的早期干預可以改善傷員預后，降低傷亡率。但是采用何種方法才能更好地預測膿毒癥的發生對研究人員和臨床醫生來說仍然是一個巨大挑戰。盡管近年來的研究發現了許多用于膿毒癥預測的生物標志物，但經實驗證實，可應用于創傷膿毒癥預測的生物學指標卻較少，且相關檢測費用較大，難以在臨床進行全面推廣和應用。

然而，單純依靠一種生物標志物難以實現快速、精準的預測膿毒癥。現在和將來需要做的是：(1)借助基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學及微生物組學等組學研究手技術，發現準確性更高的創傷膿毒癥預警生物標志物；(2)借助生物信息學和數學統計學手段，將多種生物標志物與臨床表現相結合，建立快速、準確且臨床適用性強的創傷膿毒癥預測模型；(3)開展前瞻性、多中心創傷人群驗證實驗，通過大數據分析對戰創傷感染高度可疑人群進行預判，提高膿毒癥早期預警診斷模型的敏感度和特異度，針對高危傷病員實施及時有效的綜合性治療措施，進一步提高創傷膿毒癥的救治成功率。