念珠菌感染性陰道炎的病原菌藥物敏感性及免疫功能變化

董先紅，程惠芬

(安吉縣第三人民醫院 檢驗科，浙江 安吉 313300)

念珠菌感染性陰道炎為育齡婦女常見陰道黏膜真菌感染性疾病，主要表現為外陰瘙癢、分泌物增多、呈豆腐渣樣或凝乳狀，可引起宮頸炎、流產甚至不孕[1]。流行病學研究結果顯示[2]，近年來隨著抗菌藥物的普遍使用，耐藥菌株的不斷出現，女性念珠菌感染性陰道炎的發病率呈逐年上升趨勢。目前證實，感染途徑、性傳播途徑等為引起女性發生念珠菌感染性陰道炎的主要原因[3]；除此之外，陰道局部免疫狀態的失衡在念珠菌感染的過程中也發揮重要作用[4]。本研究分析念珠菌感染性陰道炎的菌種分布與耐藥性，以期為臨床診治提供參考，同時探討Th1/Th2平衡狀態在陰道局部免疫功能中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源 2015年1月—2017年1月本院婦產科門診擬確診為念珠菌感染(外陰陰道假絲酵母菌病vulvovaginal candidiasis，VVC)的456例女性患者的陰道分泌物真菌培養標本456份，入組標準：年齡18～50歲；主訴外陰瘙癢和/或燒灼、干燥等刺激癥狀；查體可見外陰腫脹、紅斑、豆渣樣分泌物增多；生理鹽水濕片鏡檢念珠菌培養陽性(油鏡下觀察見芽生孢子及假菌絲)， 符合霉菌性陰道炎的臨床診斷標準；排除2個月內口服或外用過抗真菌類藥物的患者及妊娠或哺乳期患者。患者年齡18～50歲，平均45.5±4.6歲；病程3天～3年，平均4.5±0.5個月。本研究經我院倫理委員會同意。

1.2 培養鑒定 使用無菌試紙取患者陰道后穹窿分泌物，立即送檢，鏡檢見到假菌絲后接種于沙保弱培養基(Sabouraud’s medium)中(法國梅里埃公司生產)，37 ℃溫度下培養48 h，將酵母樣真菌(購于衛生部臨檢中心)轉種于科馬嘉念珠菌顯色培養基中(購于廣州迪景微生物科技有限公司)；37 ℃培養48 h后觀察結果。根據菌落顯色不同，參照產品說明書鑒定念珠菌菌種(綠色或翠綠色的白色念珠菌，藍色為熱帶念珠菌，粉色為克柔念珠菌)；不能鑒別菌種的使用API-20 C AUX鑒定試劑盒(購于珠海迪爾生物工程有限公司)進行鑒定。使用珠海迪爾生物工程公司生產的迪爾真菌板進行藥敏試驗。

1.3 陰道分泌物中Th1/Th2型細胞因子水平檢測 在分離培養念珠菌為陽性的標本中隨機選擇100例設為觀察組，另選取同期來本院體檢的健康女性100名為對照組。各組受試者經陰道后穹窿分泌物取出后置于含蛋白酶抑制劑的PBS液中，充分混合，2000 r/min離心采集上清液500 μL，送迪安醫學檢驗中心并采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各樣本中干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、白介素-4(IL-4)水平，并計算IFN-γ/IL-4值。

2 結果

2.1 念珠菌構成及分布特點 456例陰道分泌物真菌培養標本中，共分離培養出念珠菌278株，念珠菌檢出陽性率為60.96%(278/456)。主要檢出念珠菌(Candida)種類包括：白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、熱帶念珠菌(Candidatropical)、克柔念珠菌(Candidakrusei)等，其中白色念珠菌檢出率最高(77.7%)。

2.2 念珠菌藥敏試驗結果 念珠菌對常用幾種抗真菌藥物均具有較好的敏感性，對兩性霉素B、制霉菌素的敏感性最高(100%)。其中白色念珠菌對各抗真菌藥物的敏感性均最高。見表1。

表1 陰道分泌物檢出念珠菌的藥敏試驗結果(%)

注：R耐藥；I中敏；S敏感

2.3 Th1/Th2型細胞因子水平比較 選取的100例念珠菌為陽性患者年齡22～50歲，平均44.3±4.6歲；選取的100名同期健康女性年齡20～50歲，平均45.7±5.0歲；兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組陰道分泌物中IFN-γ、IL-12、IL-4水平均明顯高于對照組，IFN-γ/IL-4比值明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 陰道分泌物中Th1/Th2型細胞因子水平比較

3 討論

念珠菌可存在于正常人體的皮膚、黏膜或消化道中，屬于正常菌群之一，據統計，臨床上10%的健康婦女并未出現感染性陰道炎的癥狀尚可在陰道分泌物中培養出念珠菌[5]。當機體免疫力降低，或陰道局部內環境發生某種改變時，也可發生念珠菌感染性陰道炎，因此念珠菌又屬于條件致病菌[6]。本研究中，念珠菌檢出結果為陽性的278例陰道分泌物標本中，白色念珠菌檢出率最高，為77.7%。提示臨床上念珠菌性陰道炎的感染病原菌仍然以白色念珠菌為主。

由于不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性存在差異，念珠菌對不同藥物的敏感性差異也較為明顯，對于存在劑量依賴性的藥物來說，治療過程中往往需要適當增加劑量[7]。本研究藥敏試驗結果顯示，臨床常用的幾種抗真菌藥物對念珠菌的敏感性均較高，其中兩性霉素B對各種類型念珠菌的敏感性均為100%。對于白色念珠菌，除兩性霉素B以外，5-氟胞嘧啶、伏立康唑的敏感性均達到了90%以上，伊曲康唑、氟康唑的敏感性也高達85%以上。可見，白色念珠菌對上述幾種臨床常見的抗菌藥物的敏感性均較高。光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等對納入研究的幾種抗菌藥物的敏感性則存在菌種差異，且敏感性相對較低。

念珠菌作為陰道內的正常寄居菌群，在維持陰道內環境自凈及菌群平衡的過程中發揮重要作用[8-9]。目前，對于機體感染念珠菌后的自身防御機制尚不完全清楚，已經得到證實的是，當宿主發生免疫功能低下，或局部免疫功能紊亂時，可發生念珠菌感染性陰道炎[10]。輔助性T細胞(簡稱Th細胞，helper T cell)在機體抗胞內病原體感染中發揮重要作用，主要有Th1細胞與Th2細胞兩種，其中，Th1細胞主要分泌白細胞介素(interleukin，IL)-12，干擾素(interferon，IFN)-γ，IFN-a，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-β等，主要參與細胞免疫和遲發性超敏性炎癥反應；Th2可輔助B細胞分化為抗體分泌細胞，主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等，參與體液免疫應答。機體正常時，Th1和Th2細胞功能處于動態平衡狀態，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能；當機體受到異己抗原攻擊時，Th1和Th2細胞中某一亞群功能升高，另一亞群功能降低，該現象即為Th1/Th2漂移。Th1/Th2失衡是免疫應答的關鍵環節，參與了多種疾病的病理生理過程。IFN-γ、IL-12等可促使Th細胞由Th0向Th1分化，可增強吞噬細胞介導的抗感染機制，發揮抵御感染的作用，特別是細胞內寄生菌的感染；IL-4、IL-10等細胞因子則可促使Th細胞由Th0向Th2分化，增加機體對病原體的易感性[11-12]。

IFN-γ是Th1細胞的標志，可增強機體抗感染機制；IL-12作為誘導Th1細胞分化的重要細胞因子，在人體內可通過促進B細胞產生IgG發揮持續抗感染的作用[13]。本研究中發現，念珠菌感染性陰道炎患者的陰道分泌物中IFN-γ、IL-12水平明顯高于健康女性，表明發病早期以Th1介導的細胞免疫反應為主。IL-4作為Th2型細胞因子，主要由T細胞產生，對巨噬細胞、中性粒細胞的吞噬和殺傷病原體的能力有一定的抑制作用[14-15]。本研究中，念珠菌感染性陰道炎患者與正常受試者比較，存在陰道分泌物中IL-4水平明顯增高的現象，說明Th2出現了極化狀態。進一步分析Th1/Th2的平衡狀態發現，念珠菌感染性陰道炎患者IFN-γ/IL-4比值明顯低于健康人群，即Th2型細胞因子對免疫功能的抑制作用大于Th1型細胞免疫功能的發揮。分析Th1/Th2失衡導致局部免疫功能的紊亂可能減低了機體對念珠菌的抵抗能力。

綜上所述，念珠菌感染性陰道炎以白色念珠菌為主，不同的念珠菌菌種對于抗菌藥物存在不同的耐藥性及敏感性。臨床應根據菌種鑒定結果合理使用抗菌藥物。念珠菌感染性陰道炎患者存在局部免疫功能紊亂現象，如何糾正Th細胞分化失衡對念珠菌感染性陰道炎的有效治療具有重要意義。