抗結核藥鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔體內緩釋性能觀察

陳勇忠 衛秀洋 翁少煌

[摘要]目的 觀察抗結核藥鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內的緩釋性能，評估安全性。方法 選取新西蘭大白兔 48 只，將其隨機分為兩組，每組24只。實驗組在脛骨近端骨缺損置入鏈霉素-硫酸鈣顆粒;對照組植入等量的鏈霉素。采用高效液相色譜（HPLC）儀測定鏈霉素濃度。術后不同時間點抽血待檢;孔周圍取組織待檢。術后2、6周行肝腎抽血檢查及肝、腎臟組織病理切片檢查。植入部位行X線檢查。結果 實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周最低殺菌濃度（MBC），植入10周尚處于最低抑菌濃度（MIC）。靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織維持2周MBC，植入3周處于MIC;在血液維持1周MBC，植入2周處于MIC。實驗組血液和組織的藥物濃度高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。肝臟、腎臟功能生化檢查、病理切片示安全性良好，兩組肝腎功能組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。X線及病理學檢查示實驗組具有良好的成骨性。結論 鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內緩慢釋放，達到緩釋效果，對肝腎組織無損傷。

[關鍵詞]硫酸鈣;鏈霉素;緩釋顆粒;抗結核

[中圖分類號] R52? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）1（a）-0004-04

抗結核藥物——鏈霉素在臨床常肌內注射，不能口服給藥，給患者帶來不便及副作用。局部藥物緩釋系統是一種理想的給藥方式。醫用硫酸鈣不僅作為藥物載體而且作為填充骨缺損的修復材料已在臨床上應用[1-3]。本研究中把硫酸鈣鏈霉素制造成緩釋系統顆粒植入兔子內體，觀察周圍肌肉組織，血液藥物濃度，肝臟、腎臟組織病理學研究，為臨床治療骨結核提供依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

選用新西蘭大白兔 48只，體重2.5 kg（福建醫科大學動物實驗中心提供）。注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫藥，規格：1 g/瓶，國藥準字H37020187）;醫用硫酸鈣（英國百賽公司，5CC思迪骨粉）。

1.2緩釋顆粒制作

以1 g鏈霉素注射粉劑與5CC醫用硫酸鈣粉劑，混勻倒入2 ml滅菌注射用水;混均至膏糊狀（大約需30 s）。填充至3 mm×3 mm圓柱狀模具中。填充時用20 N的壓力加壓驅趕空氣，15 min固化，伸縮模具釋放顆粒（圖1a～1b）。顆粒電子顯微鏡下顯示：其中以棒狀結構為主，硫酸鈣寬度為7.5～10.0 μm，長40～50.0 μm，鏈霉素以顆粒形狀為主（5 μm×5 μm×5 μm）（圖1c）。

1.3分組及模型制作

將48只新西蘭兔隨機分為兩組，每組24只。地西泮（1 mg/kg）耳緣靜脈麻醉。單側下肢脛骨上段手術區備皮，消毒后鋪巾。以脛骨近端內側為中心做縱行切口，長約3 cm。依次切開皮膚、皮下，從肌間隙進入至脛骨內側，剝離骨膜。骨面用電鉆開槽長10 mm，寬6 mm。實驗組孔內置入滅菌的顆粒4顆，含鏈霉素約12 mg，共48 mg。對照組植入同樣份量的鏈霉素。放回籠內飼養并觀察。

1.4觀察指標

1.4.1血藥及組織濃度檢測? 于術后1、2、3 d，1、2、4、6、8、10周，取耳緣靜脈血1～2 ml待檢;在孔半徑5 mm處取0.5 mg大小組織4塊，分別粉碎后加5 ml PBS 勻漿，400 r/min 離心15 min，留取上清液-20℃凍存待檢。HPLC法測定鏈霉素濃度。

1.4.2 組織相容性測定? 術后2、6周，取植入部位、肝、腎臟組織，制成病理切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。術后2、6周抽血，行肝[丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉氨酶（AST）]、腎功能[肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）]檢查。

1.4.3 成骨性檢測? 術后1、2、4、8周行植入部位X射線檢查，了解成骨情況;術后8周植入部位取材，制成病理切片，光鏡檢查成骨情況。

1.5統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

兔麻醉清醒后，覓食水正常。實驗組死亡2只，對照組死亡1只，為保證數據的準確性，及時補充動物。死亡原因是患肢骨折后導致傷口感染。其余動物順利完成本實驗，生長平穩，傷口均能達到愈合。

2.2 藥物代謝曲線

實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周最低殺菌濃度（MBC），植入10周尚處于最低抑菌濃度（MIC）;靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織維持2周MBC，植入3周處于MIC;在血液維持1周MBC，植入2周處于MIC。兩組血液和組織的藥物濃度持續時間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3組織相容性測定

術后肝腎組織取病理檢查提示，術后早期2周、術后晚期6周細胞形態良好，腎小球、腎小管，肝組織匯管區，巨噬細胞、肝細胞形態正常。肝腎無器質性改變。

2.4藥物安全性檢測

兩組術前的肝、腎功能指標比較，差異無統計學意義（P>0.05）;兩組術后2、6周的肝、腎功能指標分別與術前比較，差異無統計學意義（P>0.05）;兩組術后2、6周的肝、腎功能指標比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.5成骨性檢測

實驗兔術后1、2、4、8周行植入部位X射線檢查，顆粒逐漸緩釋，消失。局部出現誘導成骨。術后8周實驗兔植入部位取材，制成病理切片，可見骨細胞長入，內含毛細血管，中性粒細胞（圖3）。

3討論

近年結核發病有所增加。骨結核好發于脊柱、股骨遠端、脛骨近端及膝關節。如果診治不及時或不規范，極易造成關節毀損或椎體破壞、甚至累及椎管，壓迫脊髓神經，造成癱瘓[4-5]。脊柱的椎體的上下椎板、股骨遠端、脛骨近端等部位主要由骨細胞軟骨細胞、致密膠原及糖蛋白基質共同構成，自身修復困難。同時病灶周圍壞死硬化的骨具有屏障作用，導致局部藥物濃度過低或者不能達到病灶[3，6]。鏈霉素長期使用可導致腎、耳毒性。注射部位感染、硬結、肌肉攣縮。病灶局部搭載含鏈霉素緩釋藥物人工骨支架植入是當前理想的解決策略[7-11]。醫用硫酸鈣是一種良好的骨修復填充材料，被廣泛應用于口腔科和矯形外科[12-13]。文獻報道[14-18]，硫酸鈣具備諸多理想的骨移植替代材料的特點： ①在生物體內完全吸收;② 較好的生物相容性、可成形性;③為新骨生長提供支架，填補骨缺損;誘導成骨;④自然界含量豐富。我院曾嘗試將鏈霉素和硫酸鈣做成緩釋系統應用于脊柱結核的治療，取得了預期的療效[19-20]。

實驗藥物代謝曲線顯示，組織內的鏈霉素可在體內持續釋放，能夠維持局部有效治療的藥物濃度。鏈霉素可維持高于10倍結核分枝桿菌的MIC，長達10周。文獻報道抗結核藥物一般MBC為MIC的10倍。鏈霉素的MIC為0.05 μg/ml。該顆粒在動物體內2周左右出現崩解，藥物累計釋放量突然增加，藥物濃度達到高峰，而后逐漸降低，表明存在突釋現象。藥物的突釋也是藥物工作者共同存在的問題。資料顯示，藥物突釋的定義3 d內釋放量比例不超過總量的40%[21]。本緩釋顆粒3 d時累計釋放量30%，在藥物突釋的范圍內。同時電鏡下結構顯示，鏈霉素與硫酸鈣棒狀的分子結構，分子間相互交錯成形，達到后續的緩慢釋放作用。

本研究中，實驗的血藥濃度數據顯示，實驗組在9周內均可檢測到高于10倍結核分枝桿菌的MIC，已經達到抗結核治療的目的;實驗藥物代謝曲線顯示，局部組織的藥物濃度均高于同期的血液藥物濃度，且能夠長時間維持結核分枝桿菌的MIC;組織相容性測定數據顯示，在實驗的術后早期2周時、術后晚期6周的肝腎組織病理學檢查，肝腎組織細胞形態正常，均無器質性改變;藥物的安全性數據顯示，通過肝腎功能檢查分析，術前、術后指標均無明顯升高，差異無統計學意義（P>0.05），提示該血藥濃度并無急性、慢性肝腎功能損傷。本研究中，術后影像學檢查顯示，術后1周顆粒清晰可見，術后2周左右顆粒開始模糊，提示顆粒開始出現崩解，術后4周時顆粒已經變得完全模糊，成云霧狀，提示時期顆粒已經完全崩解成細微顆粒，術后8周時顆粒已經消失，逐漸出血骨痂形成，提示硫酸鈣已經開始誘導成骨;術后病理檢查提示骨缺損處發生炎癥反應，見炎癥細胞、中性粒細胞長入、浸潤，毛細血管增殖，為成骨細胞快速分化，逐漸形成新骨骨痂。

將抗結核藥鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內實驗顯示，藥物代謝能夠保證有效濃度的情況下，無肝腎毒性。仍然存在不足，如藥物存在一定的突釋現象，緩釋顆粒的強度不夠，容易破碎。下一步解決方案在后續研究中進一步改進。

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（收稿日期：2018-09-20? 本文編輯：許俊琴）