miRNA-101調控轉化生長因子-β1信號通路參與肝纖維化的研究

白潔 紀文靜 丁永年 彭媛媛 努爾麥麥提·葉爾遜

[摘要] 目的 探討miRNA-101及轉化生長因子（TGF）-β1信號通路在肝纖維化中的作用。 方法 選取2013年1月～2018年1月新疆醫科大學第二附屬醫院手術切除的20例肝纖維化組織作為研究組，選擇20例正常肝臟組織作為對照。采用免疫組化法分別檢測肝組織中TGF-β1、平滑肌α-肌動蛋白（α-SMA）的表達水平，采用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測肝組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表達情況，分析TGF-β1、α-SMA及miRNA-101的相關性。 結果 肝纖維化組織中TGF-β1的mRNA表達水平明顯高于正常肝組織（P < 0.05），肝纖維化組織中α-SMA的mRNA表達水平與正常肝組織比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。TGF-β1和α-SMA在肝纖維化組織中的陽性表達隨肝纖維化程度的加重而增強，呈正相關（r = 0.53、0.57，均P < 0.05）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表達水平呈正相關（r = 0.633，P < 0.01）。肝纖維化組織miRNA-101水平低于正常肝組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。miRNA-101與TGF-β1、α-SMA的mRNA表達水平呈負相關（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。 結論 miRNA-101下調可能通過調控TGF-β1而參與肝纖維化。

[關鍵詞] 微小RNA-101;轉化生長因子-β1;肝纖維化

[中圖分類號] R575.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0016-05

肝纖維化是幾乎所有慢性肝損傷所伴發的病理過程，肝纖維化最后可發展為肝硬化和肝衰竭。有研究表明，肌成纖維細胞的活化參與肝纖維化發病機制[1]，其中肝星狀細胞（HSC）、門靜脈成纖維細胞和骨髓來源的膠原生成細胞是三大細胞群。轉化生長因子-β1（TGF-β1）是一種重要的促增殖介質，TGF-β1的過表達增加了膠原α1 mRNA和平滑肌α-肌動蛋白（α-SMA）的水平[2]，靶向TGF-β1可能是治療肝纖維化的一種有效方法。microRNAs（miRNAs）是內源性的23 nts的RNAs，通過與蛋白質編碼基因的mRNA配對參與基因調控[3]。研究發現，miRNAs參與促進和抑制HSC活化[4]，調節TGF-β1表達的miRNAs可能是調節TGF-β1誘導肝纖維化HSC活化的一種途徑[5]。有研究發現，miRNA-101a通過靶向c-Fos抑制心肌纖維化[6]。然而，目前關于miRNA-101靶向TGF-β1或與肝纖維化有關的報道較少。本研究對TGF-β1、miRNA-101在肝纖維化組織和正常肝組織中的表達進行分析，并分析兩組的相關性，希望為肝纖維化的預防治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2018年1月新疆醫科大學第二附屬醫院（以下簡稱“我院”）收治的20例原發性肝癌合并肝纖維化患者為研究對象，根據Ohkuma′s分級標準[7]將肝組織纖維化分為4級，其中Ⅰ級6例，Ⅱ級7例，Ⅲ級5例，Ⅳ級2例。另選擇20例因肝臟轉移癌行肝臟切除患者的肝臟正常組織作為對照。兩組年齡、性別、Child-Pugh肝功能分級等比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性，見表1。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，且患者及家屬均知曉本次診治方案，并簽字確認。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測TGF-β1和α-SMA蛋白表達及結果判定? 免疫組織化學染色方法采用SP法。TGF-β1和α-SMA單克隆抗體均購于北京中山生物技術有限公司，均為鼠抗人單克隆抗體。每組以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。其中TGF-β1和α-SMA以肝細胞膜出現黃色、棕黃色或黃褐色顆粒為陽性，同時每張切片隨機選取10個400倍視野計算視野內陽性細胞占總細胞數的百分比，取其平均數，并綜合染色強度以及陽性細胞所占比例進行判定[5]，染色強度評分：“-”為不著色，“+”為黃色，“++”為棕黃色，“+++”為黃褐色。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測肝臟TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表達? 樣本中加Trizol 5 mL反復吹打，室溫放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離，依次加入氯仿、異丙醇，4℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，1 mL 75%乙醇（0.1%DEPC水臨時配制并冰浴）洗滌RNA沉淀，4℃ 8000 g離心5 min，棄上清，自然晾干，200 μL DEPC水溶解，紫外分光光度計測定RNA濃度。使用Sigma公司TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒反轉錄合成第一鏈cDNA。選擇SimpliAmp公司的熒光定量PCR儀，采用Abcam公司的TaqMan PCR試劑盒對miRNA-101進行實時熒光定量PCR，miRNA的相對表達水平為2-△Ct，△Ct=Ct目的-Ct內參。miRNA-101上游引物為5′-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3′，下游引物為5′-TCTGGACAGTCTGCAGTTGG-3′;TGF-β1上游引物為5′-AGCCGTTTGGAGGGGCGGTT-3′，下游引物為5′-GCTGCATGGTCAGCAGGGCA-3′;α-SMA上游引物為5′-GCTGCCCAGAGACCCTGTT-3′，下游引物為5′-TTTGATGGATGCCAGCAGACT-3′;GAPDH上游引物為5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′。PCR反應體系：10×擴增緩沖液10 μL，4種dNTP混合物各200 μmol/L，引物各100 μmol，模板DNA 0.1 μg，Taq DNA聚合酶2.5 μL，Mg2+ 1.5 mmol/L，加雙蒸水或三蒸水至100 μL。按三步法進行DNA擴增，95℃ 20 s，94℃ 25 s，55℃ 15 s，75℃ 10 s，40次循環條件：72℃ 10 min。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。TGF-β1、α-SMA的mRNA表達及miRNA-101表達的相關性分析采用Pearson相關分析法，TGF-β1、α-SMA蛋白表達與肝纖維化級別的相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝纖維化組織及正常肝組織中TGF-β1和α-SMA的mRNA表達

肝纖維化組織中TGF-β1的mRNA表達[（81.6±21.6）%]明顯高于正常肝組織[（68.3±20.4）%]，差異有統計學意義（P < 0.05），肝纖維化組織中α-SMA的mRNA表達[（47.3±10.5）%]與正常肝組織[（41.1±11.3）%]比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。TGF-β1和α-SMA在肝纖維化組織中的蛋白表達隨肝纖維化程度的加重而增強，呈正相關（r = 0.53，P < 0.05;r = 0.57，P < 0.05）。見表2、圖2（封四）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表達呈正相關（r = 0.633， P < 0.01）。見圖3。

2.2 肝纖維化組織及正常肝組織中miRNA-101的表達水平比較

肝纖維化組織miRNA-101水平[（0.72±0.12）×105]低于正常肝組織[（1.05±0.02）×105]，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖4。

2.3 肝纖維化組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA表達與miRNA-101相關性分析

肝纖維化組織中miRNA-101與TGF-β1、α-SMA的mRNA表達呈負相關（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

肝纖維化是進一步向肝硬化發展的主要環節，以細胞外基質（ECM）積聚為特征。miRNA是肝纖維化的重要調控因子，多種miRNA被證實參與了肝臟纖維化過程[8-11]。

miRNA能與目標基因mRNAs的3′-非翻譯區域的多個位點相結合，并負調節靶基因表達翻譯水平[12]。由于miRNA可以調節幾個功能相關的mRNA，且一個單一的基因可能受到多個miRNA的調控[12]，近年來miRNAs在肝纖維化中的作用是研究熱點之一[8]。最近，已經報道了Let-7家族、miRNA-195、miRNA-99a、miRNA-130、miRNA-126、miRNA-230、miRNA-145和miRNA-199b在肝纖維化組織中特異性表達[8-11，13]。miRNA-101家族成員是從兩個基因組位點轉錄的高度保守的miRNAs。有研究發現，miRNA-101在心肌纖維化中下調，進一步的體內研究表明miRNA-101通過靶向c-Fos抑制心臟纖維化[6]。目前關于miRNA-101與肝臟纖維化的關系及機制尚不清楚。TGF-β信號通路中的多個成分已經被證實為miRNAs的靶點，因此，miRNAs可能參與調節TGF-β受體在HSC活化和肝纖維化形成過程中的表達。本研究關注了miRNA-101及TGF-β1在肝纖維化組織中的表達情況，結果表明TGF-β1在人肝纖維化組織中表達上調，與HSC活化有關;miRNA-101在肝纖維化組織中表達下調，其表達與TGF-β1的表達呈負相關，這與有關研究結果基本一致[14-15]。

TGF-β1是肝纖維化最關鍵的細胞因子，對肝纖維化的發生發展具有重要的作用。TGF-β1可以調控miRNAs的表達，但是miRNAs也可以影響TGF-β1信號通路蛋白的表達，從而調節TGF-β1功能[16]。TGF-β1激活HSC細胞膜的TGF-β1/SMAD信號通路進而活化HSC[18]。此外，TGF-β1可以使HSC發生快速的功能和形態學改變，并成為纖維母細胞，分泌膠原和α-SMA[19]。ECM組分的改變可進一步刺激成纖維細胞和HSC活化，反過來使TGF-β1維持高水平[20]。α-SMA是TGF-β1信號傳導通路的激活信號蛋白，有促進肝纖維化作用[17]。本研究中，TGF-β1蛋白在人肝纖維化組織中的表達明顯增高，肝纖維化組織中α-SMA的表達率較高，且隨著纖維化程度的增加，兩者表達也隨之增加。相關性分析結果顯示，TGF-β1與α-SMA表達呈正相關，提示TGF-β1可以活化HSCs，促進其向肌成纖維細胞轉化，誘導肝纖維化的發生。

總之，本研究驗證肝纖維化患者肝臟組織miRNA-101表達下調，并揭示miRNA-101可能通過調控TGF-β1參與肝纖維化，有望為肝纖維化的防治提供新的思路。但本研究缺乏miRNA-101低表達的動物體內實驗。今后，我們將通過構建肝纖維化動物模型，觀察miRNA-101表達變化，并觀察miRNA-101與TGF-β1通路的關系，以進一步驗證本研究結果。

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