京尼平苷酸對D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導的阿爾茨海默病小鼠學習記憶的影響

周張玖智 丁楊芳 胡艷麗

(石河子大學藥學院新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

阿爾茨海默病(AD)是一種臨床表現(xiàn)為進行性記憶力減退、認知功能障礙〔1〕和人格改變的多病因的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔2〕。研究表明，β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集是AD神經(jīng)元損傷的直接原因〔3〕。Aβ可活化神經(jīng)元周圍的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，促進炎癥介質(zhì)和氧自由基的釋放，如一氧化氮、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及超氧化物等。因此，Aβ引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病中起重要作用。杜仲系杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，京尼平苷酸(GPA)是其環(huán)烯醚萜類乙醇提取物，是其重要的藥理活性的化學基礎(chǔ)之一〔4〕，具有增強記憶、抗氧化(抗衰老)、鎮(zhèn)痛消炎、抗高血壓等作用〔5～8〕。研究表明，杜仲的60%乙醇提取物對異質(zhì)性及多因性AD模型大鼠的空間學習記憶有明顯的改善作用〔9〕。細胞水平研究證實，GPA可有效保護PC-12細胞免受Aβ25～35介導的細胞毒性損傷〔10〕，提示GPA在AD防治方面具有潛在作用。本實驗采用D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導的AD小鼠模型，觀察GPA對AD小鼠學習記憶的影響，并從氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面探討GPA抗癡呆的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物及飼養(yǎng)條件 昆明種成年小鼠，雄性，72只，體重23～27 g，由新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK (新)2011-0003，實驗動物使用許可證：SYXK(新)2011-0001。動物隨機分組后飼養(yǎng)于恒溫(20～24℃)、恒濕(45%～55%)的環(huán)境中飼養(yǎng)1 w。

1.2試藥與試劑 GPA(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：150512，純度>98%)，鹽酸多奈哌齊〔衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，批號：1502015，規(guī)格：5 mg/片〕，D-半乳糖(SIGMA公司，060M0063V)，亞硝酸鈉及無水乙醇均為市售分析純，二喹啉甲酸(BCA)總蛋白定量測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，20160510)，丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20160503)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：20160428)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：20160501)，IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：1321274901)、TNF-α ELISA試劑盒(批號：2411279922)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器 STT-2小鼠跳臺儀，Morris水迷宮，SBA-2小鼠避暗程序自動控制儀(中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制)，低溫冷凍離心機(5804R，Eppendorf公司)，酶標儀(Thermo3001，Thermo公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162，上海齊欣科學儀器有限公司)。

1.4樣品配制 GPA溶液配制：將250、500、750 mg GPA分別溶于100 ml蒸餾水，配成濃度為2.5、5.0、7.5 mg/ml的儲備液，以0.1 ml/10 g給小鼠灌胃，即給藥濃度分別為25、50、75 mg/kg，4℃保存。0.65 mg/kg多奈哌齊溶液配制：將6.5 mg多奈哌齊溶于100 ml蒸餾水，配成濃度為0.065 mg/ml的儲備液，以0.1 ml/10 g給小鼠灌胃，即給藥濃度為0.65 mg/kg，4℃保存。90 mg/kg亞硝酸鈉溶液配制：將900 mg亞硝酸鈉溶于100 ml蒸餾水，配成濃度為9 mg/ml的儲備液，以0.1 ml/10 g皮下注射，即給藥濃度為90 mg/kg，4℃保存。120 mg/kg D-半乳糖溶液配制：將1 200 mg亞硝酸鈉溶于100 ml蒸餾水，配成濃度為12 mg/ml的儲備液，以0.1 ml/10 g皮下注射，即給藥濃度為120 mg/kg，4℃保存。

1.5分組及給藥 小鼠隨機分成空白對照組、模型對照組、GPA組(25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg)、多奈哌齊(0.65 mg/kg)組。除空白對照組每日腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠根據(jù)體重連續(xù)皮下注射亞硝酸鈉(90 mg/kg)和D-半乳糖(120 mg/kg)60 d，建立AD小鼠模型。于造模第30天，各給藥組小鼠灌胃給予不同劑量的藥物，同時空白對照組和模型對照組小鼠分別灌服相同體積的生理鹽水，給藥時間為30 d。

1.6Morris水迷宮實驗 給予測試藥30 d后，Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力。實驗時平臺位于水面下約1 cm，水溫保持在(22 ± 2)℃，保持房間光線恒定，環(huán)境安靜。試驗分為定位航行試驗和空間探索試驗，前5 d為定位航行試驗。平臺設(shè)于西北象限中心，小鼠每天從東北象限和東南象限入水，記錄每只小鼠的逃逸潛伏期。若120 s后仍未能找到平臺，則引導小鼠至平臺停留15 s，逃逸潛伏期以120 s計，休息10 s再從另一象限入水。第6天進行空間探索試驗，其余實驗條件不改變，移去平臺，小鼠從選定象限入水，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)〔11〕。

1.7跳臺實驗 學習訓練：將小鼠置于平臺，讓其自由活動3 min以適應(yīng)環(huán)境；插上電源使銅柵通電，記錄小鼠3 min內(nèi)首次跳上平臺的時間，作為學習成績。為保證實驗的有效性和差異性，小鼠受電擊兩次后完成學習。測試階段：學習訓練24 h后，將銅柵通電，依前法將小鼠置于平臺上，記錄3 min內(nèi)小鼠跳下橡皮臺的次數(shù)(即錯誤次數(shù))和首次跳下橡皮臺的時間(潛伏期)，作為記憶保持成績〔12〕。

1.8避暗實驗 學習訓練：將小鼠放入跳臺實驗儀器中適應(yīng)環(huán)境5 min后，接通電源將小鼠背對洞口放入明室，小鼠一般會進入暗室，如小鼠不進入，則驅(qū)使其進入，使之產(chǎn)生記憶，記錄小鼠自放入明室至進入暗室的時間(即潛伏期)。24 h后依前法重復測定，記錄小鼠潛伏期及5 min內(nèi)進入暗室次數(shù)(即錯誤次數(shù))，作為測定成績〔12〕。

1.9生化指標測定 行為學試驗結(jié)束后，小鼠斷頭取腦，在冰上迅速分離皮層及海馬組織，稱重后加9倍體積的生理鹽水制成10 %勻漿，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩y定皮層及海馬組織蛋白含量、MDA含量及SOD、GSH-Px活性、IL-6及TNF-α水平。

1.10統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0 軟件進行雙因素方差分析、單因素方差分析、Dunnettt檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮 隨著實驗天數(shù)的遞增，各組逃避潛伏期呈減小趨勢。與空白對照組比較，從第2天開始模型對照組潛伏期顯著增加(P<0.01)；空間探索實驗中，模型對照組穿越平臺次數(shù)顯著低于空白對照組(P<0.01)，說明AD小鼠模型復制成功。從第2天開始，與模型組對照組比較，GPA 50 mg/kg、75 mg/kg劑量組和多奈哌齊組潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，GPA各組均不同程度增加了AD小鼠穿越平臺次數(shù)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，多奈哌齊組可顯著增加AD小鼠穿越平臺次數(shù)(P<0.01)，見表1。

2.2跳臺實驗 模型對照組的潛伏期較空白對照組顯著縮短(P<0.01)。模型對照組錯誤次數(shù)顯著多于空白對照組(P<0.01)。和模型對照組相比，GPA各劑量組和多奈哌齊組潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)；錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.01，P<0.05)，見表2。

2.3避暗實驗 與空白對照組相比，模型對照組潛伏期顯著縮短(P<0.05)。與模型對照組比較，GPA 75 mg/kg組的潛伏期顯著延長(P<0.05)，多奈哌齊組可明顯減少小鼠的潛伏期及錯誤次數(shù)(P<0.05)，見表3。

表1 各組逃避潛伏期

與空白對照組比較:1)P<0.01;與模型對照組比較:2)P<0.05;3)P<0.01，表2、3同

表2 各組跳臺實驗潛伏期及錯誤次數(shù)

表3 各組避暗實驗潛伏期及錯誤次數(shù)

2.4GPA對AD小鼠腦組織中 MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響 見表4、5。皮層與空白對照組比較，模型對照組皮層組織MDA 含量顯著升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與模型對照組比較，GPA各劑量組和多奈哌齊組可顯著降低MDA 含量(均P<0.05)；GPA各劑量組顯著升高GSH-Px活性(P<0.05)；各給藥組對SOD活性無明顯影響。

與正常對照組比較，模型對照組海馬組織MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，GPA 25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg組及多奈哌齊組可顯著增加MDA含量(P<0.05，P<0.01)；各給藥組對SOD活性無明顯影響(P>0.05)。

表5 各組海馬組織中MDA含量及SOD活性

與空白對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01；表6同

2.5GPA對AD小鼠腦皮層組織中IL-6、TNF-α表達水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組IL-6、TNF-α表達水平均顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，GPA組25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg組和多奈哌齊組可顯著降低IL-6、TNF-α表達水平(均P<0.01)，見表6。

表6 各組腦皮層組織中IL-6及TNF-α水平

3 討 論

Aβ沉積被認為是各種原因誘發(fā)AD的共同通路。Aβ由β-淀粉樣前體蛋白(APP)異常水解產(chǎn)生，有很強的神經(jīng)毒性作用，會造成神經(jīng)元變性和死亡。Aβ可激活小膠質(zhì)細胞，加強對Aβ的吞噬作用，但長期、高度活化的小膠質(zhì)細胞會上調(diào)促炎因子與細胞表面的膜蛋白表達，如IL-1β、IL-6、TNF-α、補體受體等，引發(fā)炎癥反應(yīng)〔13〕。這些因子的過度表達和復雜的相互作用關(guān)系對神經(jīng)元有損害作用，同時又可反過來刺激膠質(zhì)增生反應(yīng)，進一步加劇神經(jīng)元的退行性病變。Cagnin等〔14〕發(fā)現(xiàn)在Aβ沉積形成的老年斑周圍有大量活化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞存在，且IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子高表達，在AD患者的血液和腦脊液中也發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、TNF-α的表達明顯升高，而正常人無此表現(xiàn)。

正常情況下，機體抗氧化體系可維持自由基的代謝平衡。但隨著年齡的增長或受到某些外源性物質(zhì)的侵襲，自由基的產(chǎn)生超過機體抗氧化調(diào)節(jié)的限度，導致氧化損傷，破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，最終引起衰老，促使AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生〔15〕。MDA是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)、核酸交聯(lián)，從而損傷細胞及組織，導致機體衰老。SOD是機體抗氧化酶系的重要酶，可以催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，產(chǎn)生氧化作用相對較低的H2O2，而GSH-Px能將H2O2分解成水和分子氧，減輕或阻斷脂質(zhì)過氧化作用，保護細胞免受H2O2的侵害，從而預防自由基導致的疾病發(fā)生。若體內(nèi)SOD、GSH-Px等酶減少，將導致自由基平衡失調(diào)，使組織和細胞受到氧化損傷，從而造成機體衰老〔16〕。

D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉所致AD動物模型由羅煥敏等〔17〕于2003年提出。小鼠長期注射D-半乳糖造成自由基代謝紊亂，過量的自由基攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物，破壞神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)及功能，導致神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常；而亞硝酸鈉進入機體后，能和血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白，使其攜氧能力下降，引起腦組織缺血缺氧，從而出現(xiàn)記憶障礙。

本實驗與Zuo等〔18〕研究結(jié)果相同。GPA對D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導的AD小鼠有一定神經(jīng)保護作用，可能是通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少脂質(zhì)過氧化物形成，從而提高機體的抗氧化及自由基的清除能力；同時抑制炎癥因子的釋放，減輕小鼠神經(jīng)元細胞的炎癥損傷。改善AD動物的學習記憶能力，產(chǎn)生抗AD的藥理作用。