長鏈非編碼RNA與乳腺癌的相關性

馮雪松 魯明騫 陸海燕 蘇 進 郭 蓉

(三峽大學第一臨床醫學院腫瘤防治中心 宜昌市中心人民醫院腫瘤科，湖北 宜昌 443000)

乳腺癌全球發病率及死亡率分別超過20%和10%〔1〕。目前乳腺癌治療包括手術、化療、放療、內分泌治療和靶向治療，但治療效果有時亦不太理想。長期持續放化療會導致一定毒副反應且降低患者抵抗力而殺傷癌細胞治療效果也較差〔2,3〕。徐兵河〔4〕在中國腫瘤臨床中對乳腺癌的靶向治療進行了總結，主要體現在激素受體陽性乳腺癌的內分泌靶向治療和表皮生長因子受體(HER)-2陽性乳腺癌的靶向治療上。然而臨床上使用曲妥珠單抗治療HER2陽性、早期和轉移性乳腺癌，可從中獲益的患者不足35%〔5〕。并且新出現的耐藥問題也是亟待解決的問題。

乳腺癌組織中具有眾多差異性表達的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，不同種類的lncRNA通過干擾mRNA的剪切，誘導細胞凋亡，X染色體沉默及基因組印記等多種方式對乳腺癌發生發展等過程產生影響〔6〕。此外，目前多種lncRNA在相應的惡性腫瘤中作為分子標志物和潛在的治療靶點的潛能也得到了驗證〔7～9〕，因此，基因組學研究將為乳腺癌的檢測、診斷、治療靶點的選擇及預后情況的判斷等提供了新的可行性方案。本文總結了目前國內外關于乳腺癌中差異表達并具有不同作用的lncRNA，擬為乳腺癌的早期診斷及治療提供特異有效的靶點。

1 lncRNA概述

人類對基因組學的研究既往主要著眼于具有編碼蛋白質功能的RNA，不能編碼蛋白質的RNA被認為是無用RNA，稱為轉錄噪聲。然而就是這些RNA在細胞的增殖、分化、衰老和凋亡等生命活動中發揮著不可或缺的作用。其實從哺乳動物基因組學顯示，僅有較少的轉錄本有編碼蛋白質的功能，剩下的絕大部分為非編碼RNA(ncRNA)，約占人類基因組80%。根據轉錄本的大小可以分為兩大類，microRNA和lncRNA。其中長度大于200 nt的非編碼RNA，稱為lncRNA〔10〕。Ponting等〔11〕研究lncRNA的演變及其在轉錄調節、表觀遺傳學基因調節及疾病中的角色時推測lncRNA可能有5種不同的起源：①蛋白質編碼基因序列中斷產生；②通過染色質重排產生；③ 通過非編碼RNA反轉錄轉座復制產生；④含有相鄰重復序列的非編碼序列基因串聯產生；⑤通過基因組中插入一個轉座元件轉錄產生。然而目前關于lncRNA的起源仍沒有確定的理論。對于lncRNA的生物學功能機制，主要通過信號分子、誘餌分子、引導分子、支架分子和復合分子在染色質修飾、轉錄水平、轉錄后水平及作為結構RNA在細胞增殖、分化、衰老、死亡及腫瘤的發生、發展中發揮重要調控作用〔12〕。根據其作用及在腫瘤組織中的表達模式，可分為促癌作用的lncRNA和抑癌作用的lncRNA及兼具促癌作用和抑癌作用的lncRNA。

2 lncRNA 與乳腺癌

目前研究發現與乳腺癌相關的lncRNA有以下幾種：HOX反義基因間RNA(HOTAIR),H19,肺腺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1,類固醇受體RNA激活因子(SRA),腦胞質RNA200(BC200),LOC554202,LncRNA-ROR,JADE,應激誘導長非編碼轉錄本(LSINCT)5,結腸相關轉錄因子(CCAT)2,尿路上皮癌抗原(UCA)1,生長阻滯特異轉錄本(GAS)5,母本印記表達基因(MEG)3,失活X染色體特異轉錄體(XIST),ZFAS1,轉移抑制lncRNA(LIMT),阿霉素耐藥相關非編碼RNA(ARA)等。并且有研究發現在浸潤性乳腺癌中HOTAIR和H19的表達水平比導管癌中更高；MALAT1在所有類型細胞中都高表達；而ZFAS1在所有細胞樣本中均只微弱表達〔13〕。它們在乳腺癌的促癌、抑癌、侵襲、轉移及藥物敏感性等方面發揮重要作用，見表1。

表1 乳腺癌中常見異常lncRNA的不同作用

2.1乳腺癌中發揮促癌作用的lncRNA HOTAIR是在人成纖維細胞中被發現且以反義方式轉錄的lncRNA，在乳腺癌及其轉移部位中均可檢測到它的表達異常升高，高表達的HOTAIR會導致乳腺癌細胞的侵襲性增強，與乳腺癌的進展密切相關〔14〕，從而導致患者生存率降低及預后欠佳。而HOTAIR作為乳腺癌的預后指標，Gokmen-Polar等〔15〕認為僅適用于ER受體陰性且淋巴結轉移陽性的乳腺癌患者。因此，HOTAIR作為乳腺癌預后指標的意義相對來說比較局限。當然也有不同的觀點存在，Milevskiy等〔16〕在對乳腺癌相關基因表達數據分析時發現，在HER2受體豐富的腫瘤中HOTAIR與叉頭框轉錄因子(FOX)A1和FOXM1共表達，這些因素增強了HOTAIR在侵襲性HER2陽性乳腺癌中的預后檢測能力。

lncRNA H19是發現得最早的一個與腫瘤相關的lncRNA，它在某些腫瘤中既有促癌作用也有抑癌作用，但目前沒有H19在乳腺癌中發揮抑癌作用的報道。多項研究均發現H19對乳腺癌的發生和發展均有重要作用，因為無論在乳腺癌原發灶還是轉移灶中H19均表達增高〔17〕，高表達的H19會縮短細胞周期，加速乳腺癌細胞的增殖；并且高表達的H19與雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)存在關聯性〔18〕，作為miR-675的前體可促進乳腺癌細胞的增殖和轉移〔19〕。Sun等〔20〕研究發現H19在ER陽性乳腺癌中的表達量是在ER陰性乳腺癌中的10倍，提示H19可能是雌激素誘導基因或者與ER相互作用。H19 在乳腺癌和正常組織的差異表達為乳腺癌的診斷提供了新的生物標志物，并可能成為乳腺癌治療的新靶點。

MALAT-1于2003年通過測序和反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測被發現。Miao等〔21〕研究發現，相比于正常組織，MALAT-1在80%以上的癌組織中呈現高表達，而在乳腺癌組織中高表達的MALAT-1與淋巴轉移相關。如果抑制乳腺癌組織中MALAT-1的表達，則乳腺癌細胞的增殖、侵襲明顯受限，并可誘導乳腺癌細胞的凋亡。并且乳腺癌患者血清中的MALAT-1水平明顯高于其在良性乳腺疾病中的血清水平，且其診斷效果相當可觀。Zhao等〔22〕研究發現在ER陽性的乳腺癌細胞中，使用高濃度的雌二醇(E2)治療和單獨剔除MALAT-1后發現MALAT-1表達水平顯著下降，并且細胞的增殖和侵襲能力降低，表明其可能與乳腺癌的轉移有關。因此，MALAT-1在乳腺癌的發生發展中扮演著重要的作用，其在血清中的水平可能成為乳腺診斷的一個新的腫瘤標記物。

SRA是在乳腺癌中高表達的lncRNA中發現得較早的一類，它可以調節類固醇受體和類固醇受體激活蛋白(SEAP)的表達水平，并與ER-α和PR等協同調控乳腺癌細胞的侵襲性〔23〕。Liu等〔24〕發現SRA相關信號通路在雌激素依耐性乳腺癌中扮演著重要角色，更多的數據顯示SRA的表達水平可以作為ER陽性乳腺癌的一個新的預后指標。

BC200可作為雌激素依耐性乳腺癌的預后指標以及減低細胞增殖能力的作用靶標。Singh等〔25〕研究發現BC200在ER陽性乳腺癌中的表達水平明顯高于ER陰性乳腺癌，并且敲除BC200會導致乳腺癌細胞的增殖能力明顯下降。表明BC200在乳腺癌組織中的高表達有促癌作用。在侵襲性乳腺癌中BC200也是呈現出高表達的水平，表明其與乳腺癌的轉移也存在相關性。

乳腺癌中還有多種lncRNA均呈現高表達，LOC554202與晚期病例分期和腫瘤大小相關，在體外敲除LOC554202會降低細胞增殖擴散的能力，抑制細胞侵襲，在體內抑制腫瘤發生〔26〕。LincRNA-ROR在三陰性乳腺癌和轉移灶中高表達，通過以ADP核糖基化因子(ARF)6為靶標調節乳腺癌的侵襲性〔27〕；且其也可以和不均一核糖核蛋白相互作用抑制p53對DNA損害的反應。JADE可誘導DNA損傷反應中組蛋白H4的甲基化，異常調節參與乳腺癌的發生〔28〕。LSINCT5在乳腺癌組織中高表達，敲除LSINCT5則細胞的增殖能力下降，表明具有其促癌作用〔29〕。Cai等〔30〕通過RT-PCR發現其在乳腺癌組織中高表達，異常表達可影響Wnt信號通路，敲除CCAT2可抑制細胞的增殖和腫瘤的生長。UCA1能夠促進乳腺癌細胞由上皮細胞向間葉細胞的轉化，通過增強 Wnt/β連環蛋白信號通路提高乳腺癌細胞的侵襲性〔31〕。

目前發現的這些在乳腺癌中具有促癌作用的lncRNA增加了乳腺癌的患病風險，因此可通過相關的途徑抑制這些lncRNA的表達從而緩解乳腺癌發生發展。但具體的作用機制仍需進一步深入研究。

2.2乳腺癌中發揮抑癌作用的lncRNA GAS5是在NIH3T3細胞中發現的，對哺乳動物細胞的生長阻滯有調控作用。其在多種不同類型的腫瘤中表達降低，研究發現其具有抑制細胞增殖、轉移，誘導細胞凋亡，增強細胞對凋亡刺激物的敏感性的作用，其表達降低促進腫瘤的發生發展，包括乳腺癌〔32,33〕。并且由于GAS5表達下調多發生在乳腺癌的Ⅰ期和Ⅱ期，所以GAS5有可能成為預測乳腺癌分期的標記物之一〔34〕。這為乳腺癌的治療提供了一種新的治療思路，即誘導GAS5在乳腺癌中強制表達起到抑制乳腺癌的作用，目前研究發現可通過聯合使用傳統化學藥物和雙重磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)抑制劑〔35〕、干擾Notch途徑〔36〕及DNA甲基轉移酶抑制劑〔37〕起到強制GAS5表達的作用。

MEG3是第一個被發現有腫瘤抑制功能的lncRNA，其在乳腺癌中表達下調，通過DNA甲基化的方式抑制乳腺癌細胞的增殖。目前研究表明，MEG3還參與到p53的抑癌機制中抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移等。Sun等〔38〕研究了MEG3對乳腺癌細胞MCF7和MB231的影響，發現過表達的MEG3可以通過增強MDM2的轉錄水平激活p53的轉錄活性進而抑制細胞的增殖及轉移，并發現MEG3在乳腺癌組織中表達下調可影響乳腺癌細胞的惡性生物學行為。

XIST是由失活X染色體轉錄產生的lncRNA，對于女性細胞的X染色體失活具有重要意義。Huang等〔39〕敲除或高表達XIST 會導致Akt磷酸化作用和細胞的生存能力相應增高和降低，進一步的研究發現在乳腺癌組織中XIST和Akt的磷酸化作用呈負相關。因此，XIST主要通過抑制Akt激活而調控細胞的生存能力，進而在乳腺癌中發揮腫瘤抑制作用。

ZFAS1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中差異表達。Askarian-Amiri等〔40〕通過研究ZFAS1的同源基因ZFAS1在小鼠乳腺中的作用發現ZFAS1在人乳腺癌中可能是一個抑癌基因。

此外，還有一些lncRNA可以抑制乳腺癌轉移從而發揮抑癌作用。HIT可調控TGF-β誘導的上皮間質轉化、細胞侵襲轉移過程，剔除HIT則能夠抑制腫瘤細胞的生長、侵襲及轉移〔41〕。BCAR4可誘導結合轉錄因子促使p300組蛋白乙酰化而激活非經典hedgehog/GLI2信號通路參與乳腺癌轉移進程的調控〔42〕。NKILA能與NF-κB/人核因子κB抑制蛋白(IκB)結合形成穩定的復合物，抑制IKB激酶(IKK)誘導的IB磷酸化和NF-κB信號通路的活化，進而抑制乳腺癌的進展〔43〕。LIMT以前被命名為LINC01089，是一種高度保守的lncRNA，在侵襲性乳腺癌中可通過表皮細胞生長因子(EGF)及抑制其對刺激的反應抑制腫瘤的轉移〔44〕。

同樣的，這些抑癌作用的lncRNA可以抑制乳腺癌的增殖轉移，因此，可通過不同的途徑在乳腺癌中使其強制表達提高表達水平從而起到抑制乳腺癌增殖轉移的作用，為臨床上治療乳腺癌提供可供選擇的治療方法及提供可用于靶向治療的作用靶點。

2.3乳腺癌中發揮耐藥作用的lncRNA ARA由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PAK)3基因內含子轉錄而來，在靈長類動物中含有保守、穩定的序列。通過對lncRNA行芯片分析證實ARA的表達與乳腺癌和肝癌對阿霉素的敏感性相關。在體外下調ARA的表達，可降低細胞增殖，誘導細胞凋亡，使細胞周期停留在G2/M期，并使腫瘤轉移能力受限。此外，通過對轉錄組行芯片分析發現ARA可以參與多種促阿霉素耐藥的信號通路，其中包括MAPK信號通路，新陳代謝信號通路，細胞周期與細胞黏附相關生物通路及調控細胞進程包括轉錄進程和蛋白質加工功能等。由此推測ARA與乳腺癌的耐藥相關〔45〕。

Zhu等〔46〕通過使用阿霉素治療抵抗的乳腺癌細胞作為模型系統研究了lncRNA H19在化療耐藥性發展中的作用和分子機制。發現H19表達在蒽環類抗生素治療后和阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7細胞中顯著增加。并且進一步研究發現明H19主要通過H19-CUL4A-ABCB1/多耐藥基因(MDR)1途徑在乳腺癌化療耐藥中起主導作用。此外，Si等〔47〕發現LncRNA H19通過促凋亡基因Bcl-2誘導凋亡基因(BIK)的表觀遺傳沉默導致ER-α陽性乳腺癌中的化學治療抵抗。

為了研究哪種lncRNA的失調造成曲妥珠單抗耐藥，Li等〔48〕通過篩選了一組涉及到曲妥珠單抗耐藥細胞SKBR-3/Tr的lncRNA微陣列，發現在曲妥珠單抗治療后的乳腺癌患者組織和SKBR-3/Tr細胞中GAS5的表達降低。提示曲妥珠單抗可減少GAS5的表達。實驗發現拉帕替尼可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上調GAS5的表達，GAS5作為miR-21的一個競爭性內源RNA(ceRNA)，競爭性結合miR-21以增加張力蛋白同源物(PTEN)促進曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞的增殖及轉移。這一過程改善了乳腺癌曲妥珠單抗的治療抵抗。最終得出結論，GAS5可改善HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗的治療抵抗。這項工作提示GAS5可作為HER2陽性乳腺癌的新型預后指標和候選藥物靶標，并提高曲妥珠單抗耐藥患者的治療效果。

綜上，未來可通過不同的作用靶點改善臨床上乳腺癌的治療抵抗，從而提高乳腺癌的治療效果。但具體的作用機制及減弱或強制其表達的機制仍有待進一步探索。這也為臨床研究提供參考的額依據和方向。