中藥復方筋脈通對高糖培養SD大鼠背根神經元凋亡及NGF表達的影響

吳亞楠 梁曉春 楊丹

(1北京協和醫院中醫科，北京 100730；2昆明醫科大學第一附屬醫院)

神經元的凋亡及神經再生修復能力的減弱是糖尿病神經病變發生的根本原因之一〔1〕。因此如何減少神經元凋亡、促進神經的修復與再生是糖尿病神經病變防治的重要內容〔2,3〕。高糖狀態下神經生長因子(NGF)水平的降低是導致神經元再生修復障礙或細胞凋亡的重要原因之一〔4～6〕。本研究擬觀察中藥筋脈通含藥血清對神經元中NGF的表達及細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 從中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心購置孕15天(E15)的SPF級SD大鼠，動物許可證號：SCXK-(軍)2012-0004，從胎鼠中提取背根神經節用于培養原代細胞。SPF級雄性SD大鼠，體重280～320 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，用于制備含藥血清。

1.2實驗用藥 筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、水蛭、桂枝、元胡、細辛等組成)，由北京九龍制藥廠加工生產，每粒含生藥0.35 g，批準文號(97)京衛藥制加字〔48〕第F-292號，生產批號061019。牛磺酸，產品編號T457l，購自Sigma公司。

1.3主要試劑和儀器 Neurobasal培養基(Gibco)，0.05%胰蛋白酶，0.25%胰蛋白酶，1%膠原酶Ⅱ(國家細胞資源平臺)，胎牛血清(FBS，Hyclone)，多聚賴氨酸(Sigma)，B27(Gibco)，淋巴細胞分離液(北京中杉金橋公司)，5-氟尿嘧啶、聚乙二醇單辛基苯基醚(TritonX-100)(Sigma)，NGF(Merck Millipore)，抗NGF抗體兔來源多克隆(Abcam)，微管相關蛋白(MAP)-2兔來源多抗(Millipore)，辣根過氧化物標記羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，熒光標記原位末端轉移酶(TUNEL)試劑盒(Roche)，蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)配制試劑盒(Sigma)，原位逆轉錄酶Ⅲ反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒 (Invitrogen)，光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡(Olympus)，Line-gene熒光定量PCR檢測系統(杭州博日科技有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，激光共聚焦顯微鏡(Leica)。

1.4方法

1.4.1含藥血清的制備 取20只雄性SD大鼠飼養于SPF級環境中，將大鼠隨機分為筋脈通(JMT)組5只，牛磺酸(Tau)組5只，正常對照(Con)組10只，治療組給藥劑量按成人劑量的15倍計算〔即JMT:1.31 g/(kg·d)；Tau:1.2 g/(kg·d)〕；Con組給予等體積蒸餾水。每日灌胃2次，連續7 d。于末次灌胃后2 h內頸動脈插管取血。室溫靜置2 h后，低溫離心機4 000 r/min離心10 min分離血清，水浴滅活后分裝為1 ml/支，-80℃冰箱保存，0.22 μm濾器過濾滅菌后使用。

1.4.2DRGn的原代培養、純化及鑒定 12%烏拉坦按1 ml/100 g的劑量腹腔注射深度麻醉孕鼠，消毒孕鼠下腹部，剪開腹部取出子宮，無菌條件下逐個將胎膜剪破取出胚胎，在5倍解剖顯微鏡下用顯微鑷剖開胎鼠背部的皮膚，縱向分離組織，打開髓腔，小心分離椎管內的脊髓，然后摘取脊髓兩側呈串珠狀的背根神經節，預冷的去離子平衡鹽溶液(D-Hanks)液沖洗，眼科剪充分剪碎組織至1 mm3，加入混合消化酶10 ml(配制比例為0.1%膠原酶：0.125%胰蛋白酶=3∶1)消化10～15 min，用完全培養基終止消化，尖頭吸管小心反復吹打，直至細胞懸液呈云霧狀，200目篩網過濾，收集細胞懸液。在15 ml離心管中加入淋巴細胞分離液6 ml，將4 ml細胞懸液沿管壁緩慢滴加于分層液面上，2 000 r/min離心20 min；用細吸管插入中層絮狀區吸取細胞，置入另一50 ml離心管中，D-Hanks液重懸，再次離心棄上清。完全培養基重懸細胞并置于T75培養瓶中進行差速貼壁1 h，將貼壁較慢的神經元細胞吸出，吸取10 μl細胞懸液進行計數。按2×106/孔接種于6孔板中。4～6 h后棄完全培養基，換用無血清神經元專用培養基，培養24 h后進行MAP-2蛋白免疫熒光鑒定。剛接種的DRGn在顯微鏡下較為均勻，胞體呈圓形，有折光性。培養6 h后,神經元貼壁,少量死亡細胞漂浮，部分神經元開始長出短小突觸。換用無血清培養基培養24 h后，貼壁的神經元體積較前明顯變大，胞體成近圓形,向四周發出樹枝狀軸突,軸突相互連接形成交聯網絡狀。培養48 h后神經元胞體進一步增大,胞體可呈類圓形或三角形,同時胞體相互聚集，呈簇狀分布，周圍折光性強,軸突進一步增多，并相互交錯形成更加密集的纖維網絡。

1.4.3細胞鑒定 將DRGn細胞懸液以2×106/孔的密度接種于放置蓋玻片〔預先包被多聚賴氨酸(PDL)〕的6孔板中，細胞生長至第2天，取出蓋玻片進行細胞鑒定。4%多聚甲醛固定，漂洗后滴加0.1% Triton-X100常溫孵育，然后加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結合，漂洗后每個蓋玻片加入20 μl 1∶200稀釋的MAP-2抗體，4℃過夜，陰性對照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。先后加入20 μl 1∶100稀釋的異硫氰酸酯(FITC)耦聯山羊抗兔IgG及二脒基苯基吲哚(DAPI)工作液常溫孵育。用激光共聚焦顯微鏡進行觀察及照相，隨機選取10個視野照相，以MAP-2陽性細胞的數目占總細胞的比例為DRGn純度。DRG神經元胞質及軸突經MAP-2抗體免疫熒光染色后可呈現綠色熒光，而其他非神經細胞則未見綠色熒光，經復染后所有細胞的細胞核呈現藍色熒光。本實驗DRGn的純度達(92±0.73)%，可為后續實驗研究提供可靠的細胞模型。

1.4.4試驗分組 根據既往研究結果分為以下4個實驗分組，正常對照(Con)組、高糖(45 mmol/L葡萄糖)組(HG)、筋脈通含藥血清(JMT)組、牛磺酸含藥血清(Tau)組，設定45 mmol/L葡萄糖為高糖濃度，血清添加濃度均為10%。

1.4.5TUNEL法檢測細胞凋亡 DRGn細胞按2×106細胞/孔的密度接種于6孔板中，更換條件培養基繼續培養24 h。漂洗后用4%多聚甲醛固定樣本，加入0.1%Triton X-100室溫孵育。陽性對照組滴加50 μl TUNEL反應液，陰性對照組僅滴加標記液。熒光顯微鏡下觀察，陽性細胞可見綠色熒光標記。先后滴加50 μl過氧化物酶(POD)轉換劑及50 μl二氨基聯苯胺(DAB)溶液，細胞核有棕黃色顆粒出現時停止反應。然后經蘇木素復染，充分沖洗返藍，鏡下觀察凋亡的細胞可出現特異性棕黃色顆粒。采集圖片，每組隨機選取10個視野，最少計數500個細胞，運用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析圖片，計算出細胞凋亡率：細胞凋亡率%=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.4.6Western印跡檢測DRGn中NGF蛋白的表達 接種DRGn于6孔板中，不同條件干預24 h后細胞裂解液裂解細胞樣品，提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE電泳，每泳道加總蛋白量80 μg，進行70 V/100 V恒壓電泳，經濕轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔抗鼠NGF多克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育60 min，電化學發光(ECL)顯色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析蛋白條帶，讀取條帶面積、寬度和灰度值,以目的蛋白與內參蛋白(β-actin)的灰度比值作為目的蛋白表達的相對量，進行統計分析。

1.4.7qRT-PCR法檢測DRGn中NGF mRNA的表達 接種DRGn于6孔板，分別加入不同的條件培養基培養24 h，采用Trizol一步法提取不同培養條件下的細胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒使用說明操作，將RNA逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green I核酸染料和Line-gene熒光定量PCR檢測系統進行檢測，擴增循環：95℃ 2 min，95℃ 20 s(40個循環)，58℃ 20 s，72℃ 20 s。應用Primer 6.0軟件設計引物，上游引物：5′-GGCATTGACTCCAAGCACTG-3′下游引物：5′-ACACGCAGGCTGTATCTATCC-3’。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，生成目的基因和管家基因的濃度結果。此樣品此基因的校正后的相對含量為每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度。

1.4.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行非參數檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞凋亡率比較 與Con組(28.54±8.10)%比較，HG組的細胞凋亡率顯著升高〔(71.82±11.87)%，P<0.01〕；與HG組比較，JMT組〔(32.98±7.08)%〕、Tau組〔(37.51±8.53)%〕細胞凋亡率均顯著降低(P<0.01)。

2.2各組NGF蛋白表達比較 與Con組比較，HG組及Tau組的NGF蛋白表達顯著下降(P<0.01)，JMT組NGF蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與HG組比較，JMT組NGF蛋白的表達顯著升高，而Tau組差異無統計學意義(P>0.05)；與Tau組比較，JMT組NGF蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見表1、圖1。

2.3各組NGF mRNA表達比較 與Con組比較，HG組的NGF mRNA表達顯著降低(P<0.05)，JMT組及Tau組NGF mRNA的表達均顯著升高(P<0.01)；與HG組比較，JMT組及Tau組NGF mRNA的表達均顯著升高(P<0.01)；Tau組與JMT組間比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

圖1 各組DRGn中NGF蛋白的表達

3 討 論

研究表明〔4～6〕糖尿病周圍神經病變(DPN)發生時，胰島素作用的減弱、蛋白激酶特異性亞型的變化及神經營養因子表達的降低等多種因素均可能導致神經修復再生能力的降低。20世紀90年代，動物實驗及臨床研究即表明，神經營養因子的缺乏或有效性的減弱是DPN的發病原因之一〔7〕。神經營養因子是一具有神經營養活性的蛋白質，對神經元的發育成熟、神經損傷后的修復、功能的維持均有重要作用。它包含不同的種類，NGF就是其中一種對周圍神經系統具有神經營養活性的蛋白質，它能夠促進DRGn發育，維持其正常功能〔8〕。研究發現在背根神經節受損后很快就出現NGF水平及mRNA的變化〔9〕。在動物實驗中觀察到，NGF能夠降低由紫杉醇誘導的胎鼠背根神經元的損傷〔10〕。在細胞實驗中發現，在NGF低水平的條件下，紫杉醇可導致交感及感覺神經元軸突生長受到抑制，但提高NGF水平后，則神經元的軸突生長加速〔11〕，可見NGF在保護神經元功能及形態方面的作用。

NGF除了在維持神經元功能及形態方面的作用外，與神經細胞的凋亡還有密切聯系。神經元受損后最嚴重的結局就是發生凋亡，凋亡也是神經元受損后難于逆轉的病理基礎。研究表明，神經細胞受損后發生凋亡的機制涉及眾多途徑，其中NGF的缺乏是其中的原因之一〔12,13〕。NGF缺乏導致細胞凋亡的機制可能包括以下方面：①NGF的缺乏可以通過NGF受體途徑誘導神經元凋亡。NGF受體家族統稱為酪氨酸激酶受體(Trk)，神經營養因子通過與神經元上不同親和力的受體結合對不同的神經元有特定的營養作用。小的感覺纖維及自主神經元主要表達高親和力的受體TrkA，還有一種低親和力的受體p75NTR，兩種受體均能調節NGF的生物學效應。研究表明，在TrkA受體表達水平降低時，NGF與大鼠血旺細胞p75NTR受體結合可激活核轉錄因子(NF)-κB〔14,15〕，NF-κB廣泛存在于包括神經細胞在內的多種細胞中，是一個調節凋亡的重要轉錄因子。氧化應激、缺氧、NGF的缺乏等多種條件下均能使其表達增加〔16〕。NF-κB通過轉錄調節促凋亡蛋白Bcl-x 基因的表達，誘導神經元凋亡〔17〕。②高親和力TrkA受體信號通路的激活主要是使TrkA中的酪氨酸殘基Y490磷酸化，磷酸化的TrkA-Y490進一步激活其下游磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路，使NGF產生維持神經細胞存活的功能〔18〕。高糖狀態下氧化應激反應增強，大量產生的活性氧簇及活性氮簇阻礙了TrkA受體磷酸化過程，使NGF的TrkA受體中的酪氨酸殘基Y490發生硝基化，抑制NGF/TrkA信號轉導，同時使NGF低密度受體p75NTR表達增加，通過p75NTR信號通路誘導神經元凋亡〔19〕。③Bax是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員，NGF水平的降低可導致Bax的激活，使線粒體外膜的通透性增加，細胞色素C由線粒體內膜流至胞質，在胞質內刺激形成凋亡小體，最終激活凋亡效應器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3，誘導神經元凋亡〔12〕。由此可見，NGF缺乏與神經細胞的凋亡密切相關。課題組既往研究表明，筋脈通含藥血清干預50 mmol/L高糖培養的DRGn 24 h后，可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達，下調Caspase-3 mRNA及其蛋白的表達，從而減少細胞凋亡，其作用優于對照藥維生素C〔20〕。此外，筋脈通含藥血清還具有促進高糖培養血旺細胞的增殖，增加睫狀神經營養因子(CNTF)表達的作用〔21,22〕。本實驗也發現，筋脈通含藥血清能夠明顯減少45 mmol/L高糖培養24 h DRGn細胞凋亡率，同時可增加NGF蛋白及mRNA的表達，且升高NGF蛋白表達的作用優于對照藥牛磺酸。可見筋脈通含藥血清能抑制DRGn的凋亡，其抗凋亡的作用可能與增加NGF的表達有關。