人臍帶Wharton膠來源間充質干細胞復合藻酸鈉水凝膠構建組織工程軟骨修復兔膝關節軟骨缺損

解光越 孫振 劉冠華 孫曉威 李世超 張志勇

(唐山市工人醫院骨科，河北 唐山 063500)

因外傷、運動性損傷、老年退變等原因導致的關節軟骨損傷是臨床上常見的疾病。老年人群尤為常見。關節軟骨再生修復能力極其有限，一旦損傷，很難自身修復，并可進一步發展成為骨性關節炎，累及整個關節功能〔1,2〕。因此，對早期的關節軟骨損傷患者進行有效的干預治療具有重要的臨床意義。微骨折等傳統的治療方式均差強人意，主要以纖維軟骨修復為主，修復組織力學強度差，遠期預后差〔3〕。近些年來，軟骨組織工程技術作為一種新興的治療手段成為研究的熱門。種子細胞的選擇是軟骨組織工程重要因素之一。本研究以人臍帶Wharton膠來源間充質干細胞(MSCs)作為種子細胞，復合藻酸鈉水凝膠(Alg)構建組織工程軟骨，用于修復兔膝關節全層骨軟骨缺損。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器 Ⅱ型膠原酶、藻酸鈉鹽、蕃紅O染液、天狼星紅染液、戊巴比妥鈉、多聚甲醛(Sigma，美國)；胰蛋白酶 、DMEM細胞培養液、胎牛血清 (Gibco，美國)； 高分辨率電子計算機斷層掃描(Micro-CT，GE，加拿大)。

1.2方法

1.2.1人臍帶Wharton膠來源MSCs的分離培養 獲取足月產健康產婦臍帶組織(患者知情，并通過唐山市工人醫院倫理委員會審核批準)，無菌條件下，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，去除血污等雜物。剔除動、靜脈及外膜組織，分離出Wharton膠。眼科剪剪碎至1 mm3大小顆粒，加入3倍體積濃度為0.075%的Ⅱ型膠原酶，37℃下磁力攪拌消化過夜。加胎牛血清(FBS)終止消化，離心10 min，去上清，PBS洗3遍，加入含有用含10%胎牛血清培養基吹打均勻后接種至培養瓶中，置于37℃,5% CO2培養箱中孵育。每2～3 d更換培養液。第3代(P3代)細胞用于兔膝關節全層軟骨缺損修復。

1.2.2人臍帶Wharton膠MSCs復合Alg修復兔膝關節股骨滑車骨軟骨缺損 將含有4×105/ml人臍帶Wharton膠MSCs的細胞懸液與等體積濃度為2.4%藻酸鈉溶液充分混合。向混合液中添加102mmol/L CaCl2溶液使海藻酸鈉溶液成水凝膠膠，獲得細胞終濃度為2×105/ml的人臍帶Wharton膠MSCs/Alg組織工程復合物。選取24只3月齡新西蘭大白兔，雌雄不拘(由唐山市工人醫院實驗動物中心提供，并通過醫院倫理委員會審核)。按軟骨缺損修復方式的不同，隨機均分為三組：Alg+MSCs組；Alg組；單純缺損組。術前禁食12 h，戊巴比妥鈉誘導麻醉成功后，雙膝關節取外側縱切口，脫位髕骨，暴露股骨滑車，使用直徑2 mm的無菌環鉆造直徑2 mm，深1.5 mm圓柱形全層骨軟骨缺損。Alg+MSCs組軟骨缺損以人臍帶Wharton膠MSCs/Alg組織工程復合物修復；Alg組軟骨填充以單純Alg；單純缺損組的軟骨缺損曠置作為對照。術后3個月、6個月處死實驗動物取材。

1.3檢測指標

1.3.1Micro-CT 掃描 術后6個月處死實驗兔子，獲取膝關節，4%多聚甲醛固定24 h后置Micro-CT下掃描。三維重建軟骨修復興趣區后進行一下軟骨下骨形態學參數分析：骨體積分數(BV/TV)、骨礦物質密度(BMD)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)等。

1.3.2大體觀察及國際軟骨性復協會(ICRS)評分 獲取術后3個月、6個月標本，分別由3個技術熟練的人員仔細觀察修復組織的大體表現，并記錄修復組織的色澤、與周圍正常軟骨整合等情況。并按照ICRS提出的評分標準進行大體觀評分。

1.3.3病理學染色及組織學評分 術后3個月、6個月處死實驗動物，獲得膝關節，多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片。分別進行蕃紅O染色觀察修復組織軟骨細胞外基質沉著，天狼猩紅染色觀察修復組織的膠原成分以及膠原排列。根據Wakitani 組織學評分準則進行組織學評分。

1.3.4力學檢測 獲取術后6個月膝關節樣品，對修復軟骨進行力學檢測，分別分析硬度、折合模量、接觸剛度等參數，以正常軟骨為對照。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析及SNK檢驗。

2 結 果

2.1Micro-CT掃描 術后6個月，各組軟骨下骨均得到一定程度的重建。BV/TV、BMD、Tb.Th、Tb.N等骨形態學參數分析結果顯示，Alg+MSCs組均顯著高于Alg組和單純缺損組(P<0.05)，見表1，表明Alg+MSCs相較其他兩組獲得更佳的軟骨下骨重建。

2.2大體觀察及評分 大體觀察顯示術后3個月，Alg+MSCs組的修復組織表面光滑，色澤紅潤，與周圍正常軟骨的界限模糊。Alg組和單純缺損組的修復組織表面欠光滑，色澤暗淡，與周圍正常組織的界面明顯。術后6個月，Alg+MSCs組修復組織色澤與正常軟骨相近，與周圍正常組織整合良好。Alg組和單純缺損組的修復組織粗糙，與正常軟骨存在明顯的界限。ICRS大體觀評分顯示，各個時間點Alg+MSCs組均顯著高于其他兩組(P<0.05)，見表1。

表1 術后各組軟骨下骨Micro-CT掃描參數、ICRS大體評分組織評分比較

與同時間點Alg組比較：1)P<0.05，與同時間點單純缺損組比較：2)P<0.05，下表同

2.3病理學染色及組織學評分 蕃紅O染色結果顯示：術后3個月，Alg+MSCs組修復組織以透明軟骨為主，著色與正常軟骨組織接近，其內可見排列較規則的透明軟骨細胞，軟骨陷窩明顯，新生軟骨與周圍正常組織整合較好。Alg組和單純缺損組的修復組織以纖維樣組織為主，著色淺淡，其內可見大量成纖維樣細胞，與周圍組織整合差。術后6個月Alg+MSCs組修復組織著色與正常軟骨非常接近，修復組織內可見大量軟骨細胞及陷窩，細胞排列方式更趨向正常軟骨組織。Alg組和單純缺損組的修復組織仍以纖維樣組織為主，與周圍正常軟骨組織存在明顯的界限(見圖1)。

N表示正常軟骨，R表示修復組織，箭頭示修復組織與正常軟骨的交界區圖1 術后6個月修復組織蕃紅O染色

天狼猩紅染色結果顯示：術后3個月，Alg+MSCs組修復組織內富含Ⅱ型膠原，膠原排列方向較規則。Alg組和單純缺損組的修復組織內膠原類型主要為Ⅰ型和Ⅲ型，僅見少量Ⅰ型膠原。術后6個月，Alg+MSCs組修復組織內可見大量Ⅱ型膠原，膠原排列方向與周圍正常軟骨組織相近。Alg組和單純缺損組的修復組織內仍以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主，膠原排列雜亂無章(見圖2)。組織學評分結果顯示Alg+MSCs組各個時間點均顯著高于Alg組和單純缺損組(見表1)。

2.4力學檢測 術后6個月，對修復組織的力學性能進行檢測，結果顯示Alg+MSCs組修復組織的硬度和折合模量均顯著高于其他兩組(P<0.05)，與正常軟骨組織相似(P>0.05)。Alg+MSCs組修復組織的接觸剛度小于正常軟骨組織(P<0.05)，但顯著高于Alg組和單純缺損組(P<0.05)(見表2)。

N表示正常軟骨，R表示修復組織，箭頭示修復組織與正常軟骨的交界區圖2 術后6個月修復組織天狼猩紅染色

3 討 論

我國已經進入老齡化社會，現65歲以上的老年人口占總人口的8.5%，且平均老齡人口每年以3%的速度在持續增長。接近1億人以上的老年人患有骨性關節炎。骨性關節炎引起疼痛、關節攣縮、活動障礙已經嚴重影響老年人的日常生活。骨性關節炎表現為關節腔局部的炎癥合并有不同程度的軟骨損傷，而常見骨性關節炎的治療策略往往單純解決炎癥問題，軟骨損傷依然存在。所以，解決老年人關節疼痛，同時控制炎癥及改善軟骨損傷尤為重要。

關節軟骨覆蓋于關節表面，具有傳遞分布負荷，減少骨端摩擦等作用。因其缺乏血管、神經支配，再生修復能力極其有限，一旦損傷，難以繼續自身修復，這已達到國內外學者的共識〔1，2〕。隨著關節軟骨損傷病情的進展，可累及軟骨下骨，發展成為骨性關節炎，影響整個關節，導致不同程度的關節功能喪失。關節炎晚期，關節置換成為無奈之舉。這不僅嚴重影響患者的生活質量，而且給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。因此，對關節軟骨損傷患者提供有效的干預治療措施具有十分重要的臨床意義。藥物對癥治療、微骨折技術等傳統的治療方法均未取得令人滿意的效果。組織工程作為一種新興的技術為組織再生修復提供了全新的思路和策略〔4〕。

種子細胞、支架材料、細胞因子是組織工程的三大重要因素。軟骨組織工程的基本構思為選擇合適的種子細胞在體外擴增至足夠數量后與生物支架復合，構建具有功能的組織工程化軟骨組織，再移植至軟骨缺損處，以期修復軟骨組織損傷。軟骨細胞是常用的種子細胞之一，臨床上自體軟骨細胞移植(ACI)技術通過在患者膝關節非負重區取一小塊軟骨，體外進行培養擴增后再移植至軟骨缺損處〔5〕。這種“拆東墻補西墻”的有創取材方式可能造成供區病變，而且軟骨細胞在平面培養的過程中容易去分化，從而不同程度失去分泌軟骨細胞外基質的能力，勢必影響構建組織工程軟骨的質量以及后續的軟骨修復〔6〕。干細胞具有自我更新，多向分化等潛能，被作為重要的種子細胞來源。胚胎干細胞因面臨倫理，移植后致瘤等問題，應用受到一定限制〔7〕。MSCs獲取更容易，不受倫理限制，成為研究的熱點。骨髓MSCs和脂肪肝MSCs是應用非常廣泛的兩種干細胞類型，但也存在諸多局限。如移植至體內后可能出現異位成骨，成脂等現象。另外隨著年齡的增長，其自我更新和多向分化能力均明顯下降〔8,9〕。因此，探索更佳的種子細胞是軟骨組織工程面臨的重要問題之一。 胎兒來源的MSCs被認為是非常有前途的種子細胞。臍帶為胚胎外組織，獲取較方便，而且不受倫理學的限制。Wharton膠為臍帶血管周圍的黏蛋白樣組織〔10〕。人臍帶MSCs(hWJMSCs)相比成人來源的MSCs具有更快的擴增速度和增殖能力，可成軟骨方向分化，致瘤性低。另外臍帶Wharton膠的細胞外基質成分與軟骨細胞外基質成分相似，同時hWJMSCs表達蛋白多糖，Ⅱ型膠愿等軟骨相關基因。而且hWJMSCs表達的相關生長因子、趨化因子及細胞因子的水平與軟骨細胞相仿，因此hWJMSCs被認為軟骨組織工程非常有前途的種子細胞類型〔11,12〕。本研究以hWJMSCs作為種子細胞復合藻酸鈉水凝膠構建組織工程軟骨可有效修復兔膝關節軟骨缺損。這為軟骨組織工程種子細胞的選擇提供了新的思路，也為后續的臨床轉化醫學研究提供了動物研究基礎。