低劑量促紅細胞生成素對大鼠腎移植物急性炎癥反應的影響

徐鑫梅 譚州科 楊亦彬 容松

(遵義醫學院附屬醫院 1臨床技能實驗教學中心，貴州 遵義 563000；2腎內科；3遵義醫學院器官移植中心)

腎移植是終末期腎病患者首選治療方案，但腎移植后的免疫排斥反應和缺血再灌注損傷(IRI)可導致腎移植物損傷，其損傷過程大多通過炎癥細胞浸潤移植物及炎性因子釋放等引發的炎癥反應完成，可顯著影響腎移植物功能恢復甚至喪失腎功能，從而嚴重影響腎移植物的中遠期存活率。因此，提高腎移植物長期存活率仍是目前臨床面臨的一個挑戰〔1～3〕。

促紅細胞生成素(EPO)主要在腎臟合成，除了造血功能外，還具有多效性保護作用，主要有抗氧化應激、抗炎癥反應、抗凋亡、促進血管新生及減輕纖維化等作用〔4,5〕。腎移植過程中不可避免發生缺血再灌注損傷(IRI)。本實驗擬探討低劑量EPO對大鼠腎移植物急性炎癥反應的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1動物模型及標本 清潔級健康雄性Lewis大鼠6周齡，體重150～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0008。隨機分為假手術組、腎移植模型組、EPO給藥組，每組10只。腎移植模型組及EPO給藥組做單側腎移植模型，假手術組僅分離左側腎蒂不做腎移植手術，并去除右腎。假手術組、腎移植模型組術前1 d均注射等體積生理鹽水；EPO給藥組術前1 d及術前當天皮下注射人重組EPO(rHuEPO)300 μg/kg。術后24 h處死各組大鼠，取移植腎并分成3份：1份放入甲醛中保存，24 h后石蠟包埋，用于病理染色；2份放入液氮中快速冷凍后-80℃保存，用于免疫組織化學檢測。

1.2大鼠腎組織病理學檢查 通過PAS染色觀察腎組織病理變化，于400倍鏡下采集染色圖像，每張切片采集10個不重復視野，觀察各組大鼠腎組織損傷情況。

1.3免疫組織化學方法檢測腎組織中單核/巨噬細胞表面標志物(ED)-1、 誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達 各組大鼠腎組織切片應用德國萊卡IPWin32采圖系統進行采集，每張切片隨機采集10個視野。以Image-proplus6.0為工具，以平均積分光密度(AIOD)為指標進行半定量分析。AIOD即平均光密度的乘積與陽性表達面積的均值，其大小既反映免疫組化陽性部分的強度又可反映陽性部分的面積，可以比較真實反映抗原的半定量數量。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1腎臟病理改變 腎移植模型組腎小管管腔擴張，管腔內可見脫落的細胞和細胞碎片，腎小管上皮細胞壞死明顯；EPO給藥組腎小管管腔擴張、管腔內碎片脫落、腎小管上皮細胞壞死明顯減輕；假手術組基本正常。見圖1。

圖1 各組腎組織病理變化(PAS染色，×400)

2.2腎組織中ED-1表達 ED-1主要表達于腎間質，EPO給藥組與腎移植模型組相比，ED-1炎性細胞浸潤明顯減少(P<0.01)，但EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 各組腎組織中ED-1表達(免疫組織化學，×400)

2.3腎組織中iNOS表達 iNOS主要表達于腎小管上皮細胞細胞質，腎移植模型組明顯高于EPO給藥組(P<0.01)，而EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術組(P<0.01)。見圖3，表1。

圖3 各組腎組織中iNOS表達(免疫組織化學,×400)

2.4腎組織中Caspase-3表達 Caspase-3主要表達于腎小管上皮細胞細胞質，EPO給藥組Caspase-3表達較腎移植模型組明顯減少(P<0.01)，而EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術組(P<0.01)。見圖4，表1。

圖4 各組腎組織中Caspase-3表達(免疫組織化學，×400)

組別ED-1iNOSCaspase-3腎移植模型組19.56±5.912)28.95±5.832)12.89±2.992)EPO給藥組7.88±1.681)2)10.39±2.011)2)5.85±1.171)2)假手術組2.89±0.981)6.06±0.841)1.45±0.881)

與腎移植模型組比較：1)P<0.01;與假手術組比較：2)P<0.01

3 討 論

腎移植后一旦發生IRI，可立即啟動炎癥反應。當氧供不足及再次供氧時，由于糖原缺乏、腺苷三磷酸耗竭、活性氧及氧自由基的產生等，均會導致分子代謝變化，分子代謝變化又可導致各種細胞、因子發生變化，因此腎移植后的IRI正是由于細胞、因子的變化而引發的炎癥反應〔6，7〕。這些細胞、因子的變化可能有：(1)炎癥細胞活化、浸潤：炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等被活化，活化后的炎癥細胞可釋放炎性因子、趨化因子、氧自由基等，而炎性因子、趨化因子、氧自由基又可再反作用于炎癥細胞，使炎癥細胞進一步遷移、浸潤到組織受損區，而在IRI 早期階段(再灌注后24 h內)浸潤的巨噬細胞表現出了促炎作用〔8～11〕。(2)氧化作用：IRI時，iNOS表達增多，iNOS來源的NO生成增多，而且iNOS來源的NO具有損傷性，損傷性NO可與活性氧自由基反應生成過氧亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽可引起細胞膜過氧化，抑制蛋白質功能，破壞核酸及染色體，對組織細胞造成傷害，甚至凋亡。iNOS 被認為是炎癥介質之一，又可促進炎癥細胞的活化和浸潤、其他炎性因子、趨化因子等的釋放，在炎癥反應中具有重要的細胞毒作用〔12，13〕。(3)細胞凋亡：IRI時，鈣超載及線粒體功能障礙、氧自由基的生成等，誘導及調控細胞凋亡基因(如Caspase蛋白酶)的表達，其中Caspase-3是凋亡級聯反應中最重要的凋亡蛋白酶，最終導致細胞凋亡〔14，15〕。炎癥反應的各個因素不是孤立、單向性的，而是互相作用形成復雜的炎癥反應網絡及不斷擴展的級聯連鎖反應。

本實驗結果顯示，腎移植模型發生明顯的炎癥細胞浸潤、氧化，趨化因子釋放，細胞凋亡等。

EPO是一種34 kD糖蛋白激素樣物質，可促進紅細胞生成，臨床上廣泛用于治療貧血〔16〕。近年來研究發現，EPO還具有多種保護性作用，最重要的是 EPO具有抗氧化、抗炎癥反應、抗凋亡等作用〔17〕。Jiang等〔18〕研究發現在腦缺血再灌注損傷模型中，EPO可減輕腦細胞凋亡。Rong等〔19〕研究發現，在心肌IRI模型中，EPO可通過抑制炎癥介質的生成及釋放減輕炎癥反應對心肌組織的損傷。Zhang等〔20〕研究發現，EPO可通過減輕炎癥細胞浸潤、下調炎性因子及凋亡蛋白的表達等減輕大鼠腎移植后的炎癥反應。

本實驗采用低劑量EPO干預，是因為有研究發現低劑量EPO與高劑量EPO同樣發揮組織器官保護作用，而高劑量EPO可造成血栓形成、紅細胞數增多等不良反應〔21〕。本研究結果顯示，低劑量EPO干預后，腎移植后急性炎癥反應明顯減輕，腎小管上皮細胞壞死、空泡狀變性明顯改善，ED-1、iNOS、Caspase-3的表達水平均明顯降低，說明EPO可減輕腎移植后的炎癥反應，其可能通過減少炎癥細胞的浸潤、細胞因子的釋放，抗氧化、抑制凋亡等作用，減輕大鼠腎移植后炎癥反應對腎移植物的損傷，從而發揮保護大鼠移植腎功能的作用。