氧化應(yīng)激損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞對瓣膜間質(zhì)細(xì)胞生長的調(diào)控

吳昊 李寧 龔德軍 夏翠萍 李芹 陶婧 劉曉紅 徐志云

(上海長海醫(yī)院心血管外科，上海 200433)

氧化應(yīng)激(OS)是指機體在遭受各種刺激時，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生過多的活性氧自由基，引起細(xì)胞和組織損傷〔1〕。OS損傷主要包括損傷生物膜、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變形、DNA損傷、脂質(zhì)過氧化，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡并引發(fā)疾病〔2～5〕。現(xiàn)已證實OS是鈣化性心臟瓣膜病的首發(fā)因素〔6〕，是導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞(VICs)凋亡、表型分化的重要因素。鈣化性心臟瓣膜病多見于60～65歲以上的老年人，其特征性的病變是纖維化、鈣化。心臟瓣膜組織由VICs、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)及細(xì)胞外基質(zhì)組成。ECs在瓣膜表面，可保護(hù)瓣膜內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)。VICs是最主要的細(xì)胞成分，在瓣膜的病變中起著重要作用〔7,8〕。長期以來，研究者的目光都集中在ECs或VICs等某一單一細(xì)胞種類上，而對其之間的相互聯(lián)系和相互作用的研究甚少。因此，探索ECs和VICs之間的聯(lián)系對瓣膜病的進(jìn)一步認(rèn)識有重要意義。本實驗通過建立OS-ECs模型，觀察損傷的ECs對VICs生長的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)購自ScienCell公司，伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，過氧化氫(H2O2)購自Sigma公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自Dojindo公司，抗Caspase-3抗體、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)-抗體購自Abcam公司，α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體購自Affinit公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存于液氮中的ECs復(fù)蘇并培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素、鏈霉素混合液及1%ECs生長因子(ECGS)的ECM中，于37℃、5%CO2的恒溫箱中貼壁生長，待貼壁細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)皿80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，接種于6孔板。

1.2.2VICs的分離及培養(yǎng) 取新鮮豬瓣膜，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗后，剪碎組織，通過酶消化法收集細(xì)胞混懸液，移至10 cm培養(yǎng)皿中，于含10%FBS、1%青霉素、鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的恒溫箱中貼壁生長。待貼壁細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)皿80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3OS-ECs模型的建立 待ECs細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，以2 ml/孔接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，更換含不同濃度梯度H2O2溶液(0、10、50、100、150 μmol/L)的0.5%FBS、1%雙抗及1% ECGS的ECM，分別收集24 h、48 h、72 h、96 h后各個濃度的分泌物上清液。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)確定H2O2處理的最佳濃度為50 μmol/L。

1.2.4OS-ECs上清制備與收集 在OS模型建立的基礎(chǔ)上，選用50 μmol/L濃度的H2O2處理ECs，分別收集24 h、48 h、72 h、96 h后各濃度OS-ECs上清液。

1.2.4.1Western印跡法 待VICs融合度達(dá)約80%時，接種于6孔板，分別加入不同時間(24 h、48 h、72 h、96 h)作用下的OS-ECs上清液2 ml，37℃、5%CO2孵育24 h后提取總蛋白，煮沸變性后進(jìn)行蛋白定量。取制備好的蛋白標(biāo)本進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入α-SMA(1∶800)、Caspase-3(1∶5 000)，PCNA(1 μg/ml)一抗,4℃孵育過夜。次日雜交膜清洗液(TBST)洗膜后加入相應(yīng)二抗，孵育結(jié)束后曝光顯影。采用ImageJ軟件分析Western印跡條帶灰度值。

1.2.4.2CCK-8 在96孔板中接種VICs細(xì)胞懸液100 μl/孔。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2預(yù)培養(yǎng)。待VICs貼壁后，實驗組分別加入各濃度各時間段的OS-ECs上清，對照組加入等體積的0.5% FBS、1%雙抗及1%ECGS的ECM。分別于24 h、48 h、72 h、96 h后，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.3統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1OS-ECs模型的建立 OS作用下的ECs形態(tài)均有不同程度的改變，其中，各個時間段中，50 μmol/L濃度的H2O2作用下有大量細(xì)胞存活。細(xì)胞培養(yǎng)至24 h時，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，鋪路石樣排列，呈圓形或卵圓形，胞體豐滿，大小較均一，細(xì)胞之間界限清楚。48 h略有皺縮，體積稍有縮小，72 h后皺縮明顯，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞脫壁懸浮，細(xì)胞密度明顯減小。見圖1。

圖1 50 μmol/L H2O2氧化應(yīng)激作用下ECs在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)(×40)

2.2OS-ECs上清液對VICs分化的作用 Western印跡檢測表明VICs在OS-ECs上清液處理48 h后α-SMA表達(dá)顯著升高，其表達(dá)量與24 h相比差異顯著(P<0.05)。72 h后α-SMA的表達(dá)量回落，并維持在初始水平，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡法檢測α-SMA的表達(dá)

2.3OS-ECs上清液對VICs凋亡的作用 Western印跡法檢測表明VICs在OS-ECs上清處理48 h后Caspase-3表達(dá)顯著升高，與24 h相比差異顯著(P<0.05)。72 h后表達(dá)量回落，并維持在初始水平，與24 h比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表1。

圖3 Western印跡法檢測Caspase-3的表達(dá)

2.4OS-ECs上清液對VICs增殖活性的作用 Western印跡法檢測表明VICs在OS-ECs上清液處

理后PCNA的表達(dá)量隨著時間的延長而降低，但48 h、72 h、96 h PCNA的表達(dá)量與24 h相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表1。CCK-8結(jié)果表明，在OS-ECs上清液作用的各個時間點與24 h相比，VICs的存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖4 Western印跡法檢測PCNA的表達(dá)

組別a-SMACaspase-3PCNAVICs存活率(%)24 h0.786 8±0.239 10.803 5±0.268 00.939 6±0.210 30.515 8±0.208 148 h1.389 1±0.241 11)1.287 3 ±0.157 71)1.051 9±0.211 20.516 3±0.125 572 h0.935 8 ±0.287 60.549 2±0.262 10.840 3±0.407 40.403 8±0.082 496 h0.899 1±0.417 90.624 9±0.275 90.689 6±0.447 50.479 3±0.054 3

與24 h比較:1)P<0.05

3 討 論

VICs生物學(xué)行為的改變是導(dǎo)致瓣膜病最主要的原因〔9〕。本研究提示在H2O2的作用下，OS對Ecs的損傷隨著時間的延長而加重。結(jié)果表明在ECs損傷早期，OS-ECs上清能促進(jìn)VICs表達(dá)α-SMA和Caspase-3。α-SMA是肌纖維母細(xì)胞分化的表型標(biāo)志物，在組織損傷修復(fù)過程中，通過合成分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)組織損傷修復(fù)，但是肌纖維母細(xì)胞過量增生分化也可導(dǎo)致瓣葉纖維化。正常情況下，Caspase-3無活性，在凋亡刺激的作用下被激活進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此Caspase-3被認(rèn)為不僅是重要的凋亡執(zhí)行者，而且是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點。在前期研究中，本課題組的研究也表明Caspase-3介導(dǎo)的凋亡在瓣膜鈣化過程中也發(fā)揮著重要的作用〔10〕。另外，在ECs損傷過程中發(fā)現(xiàn)其上清對瓣膜間質(zhì)細(xì)胞增生無明顯調(diào)控作用，PCNA蛋白表達(dá)量和CCK-8增殖活性均無明顯改變。證實ECs在損傷早期能通過旁分泌的方式促進(jìn)VICs向肌纖維母細(xì)胞分化和凋亡。