四君子湯對人乳腺癌MDA-MB-231細胞生長及PD-L1表達的影響*

李朵璐，張待娣，楊 盟，柴玉娜

(鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中較為難治的特殊類型，具有雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體免疫組化標記均為陰性的特點。TNBC的病因至今尚未明確，腫瘤細胞免疫逃逸是目前公認的治療障礙。近年來發現，以程序性死亡-1因子(programmed death-1, PD-1)及其配體(programmed death ligand 1, PD-L1)為阻斷靶點進行免疫治療，能夠抑制TNBC化療耐藥[1-2]。中醫學治療TNBC的關鍵在于益氣健脾。已有研究證明：益氣健脾方藥四君子湯可顯著提高乳腺癌患者的生存質量[3]，調節乳腺癌患者的免疫系統功能，主要成分能夠降低PD-L1表達[4]。本研究以前期實驗篩選出的PD-L1高表達TNBC細胞為研究對象，觀察四君子湯對細胞增殖、凋亡及免疫相關因子PD-L1表達的影響，以期為深入研究TNBC的發病機制、尋找可能的藥物靶標奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與細胞培養

人三陰性乳腺癌細胞(MDA-MB-231)購自美國典型培養物保藏中心。細胞均使用含體積分數100 mL/L 胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養基在37 ℃、飽和濕度、體積分數50 mL/L CO2的細胞培養箱中培養。

1.2 藥品、試劑與儀器

四君子湯由人參、白術、茯苓及甘草4種中藥組成。藥材購自鄭州大學第一附屬醫院藥房，加入10倍體積純水浸泡1 h，然后煎煮提取1.5 h，紗布過濾收集濾液，靜置沉淀取上清液，放入旋轉蒸發儀濃縮后，用烘干箱干燥，得到干粉。四君子湯提取干粉采用高效液相色譜進行質量控制。使用前用天平稱取四君子湯干粉10 mg，用5 mL培養基配成高劑量(2 g/L)溶液，用無菌濾膜過濾后用培養基依次梯度稀釋成中劑量(1 g/L)溶液和低劑量(0.1 g/L)溶液。紫杉醇(Paclitaxel，10 mM)，購自MCE公司。先將紫杉醇用DMSO稀釋成10 μM 的母液儲存，使用前再加入培養基稀釋至5 nM。 細胞增殖/毒性實驗(cell counting kit-8,CCK8)試劑盒,購自US Everbright 公司，Cat.No.C6005-500T，Lot.No.FC0720；FITC Annexin V/ PI 細胞凋亡檢測試劑盒，購自GeneCopoeia公司，Cat. No. A026，Lot. No. A2K1626。Odyssey CLX型紅外熒光掃描成像系統，美國LI-COR公司產品；MK3型酶標儀，美國Molecular Devices分子儀器有限公司產品；FACSCanto II型流式細胞儀，美國BD公司產品。

1.3 檢測指標

1.3.1 CCK-8法檢測細胞增殖

將處于對數生長期的TBNC細胞MDA-MB-231接種于96孔板，調整細胞密度，每孔體積100 μL，置于培養箱(37 ℃、50 mL/L CO2)培養；待細胞完全貼壁后，分別更換含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)的四君子湯提取物和紫杉醇，以及不含二者的培養液100 μL；分別在孵育24，48，72 h后，加入10 μL CCK-8溶液。另設調零孔，每組5個復孔，將培養板在培養箱中孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度OD值，計算出各組細胞抑制率。抑制率=[(對照組OD值-本底OD值)-(給藥組OD值-本底OD值)]/(對照組OD值-本底OD值)×100%。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡

采用FITC Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。選擇處于對數生長期的TBNC細胞MDA-MB-231接種于6孔板，待細胞貼壁完全后，加入含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)的四君子湯提取物和紫杉醇，以及不含二者的培養液，培養箱培養48 h。根據以下步驟操作：①用不含EDTA 的胰酶消化后，300×g，4 ℃離心5 min收集細胞。②準備陽性實驗對照組，使用合適的方法誘導細胞凋亡，同時準備未經凋亡誘導處理的細胞作為空白對照組。③用 4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300×g，4 ℃離心 5 min。④配制 1×Annexin-binding buffer。用去離子水按1∶5稀釋5×Annexin-binding buffer(組份C)(2 mL 5×Annexin-binding buffer+8 mL 去離子水)。⑤用 1×Annexin-binding buffer 重懸細胞，調節其濃度為1×106細胞/mL。⑥取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC Annexin V(組份 A)和 1～2 μL PI(組份B)，輕輕混勻。⑦室溫、避光、反應 15 min。⑧加入400 μL 1×Annexin-binding buffer，輕柔混勻，冰上放置。⑨在1 h內，進行流式細胞儀的觀察和檢測，激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=530 nm。FITC Annexin V綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測；PI 紅色熒光通過 PI 通道(FL2 或 FL3)檢測。

1.3.3 Western blotting檢測細胞中PD-L1表達水平

用細胞裂解液處理高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1g/L)四君子湯提取物和紫杉醇培養的TBNC細胞MDA-MB-231，提取總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度；取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，70 ℃變性10 min，聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉1h后依次加入相應的一抗和二抗孵育。室溫下TBST漂洗孵育過的條帶3次，每次5 min。使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統進行掃膜曝光。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 各組TNBC細胞MDA-MB-231抑制率對比

各時間點抑制作用以紫杉醇組最為顯著；四君子湯各劑量組，在72 h時抑制作用最明顯，但即使是高劑量四君子湯組，抑制率也顯著低于紫杉醇組，差別有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組TNBC細胞MDA-MB-231抑制率對比

組別 劑量24 h抑制率/%48 h抑制率/%72 h抑制率/%空白對照組----紫杉醇組5 nM8.1629.5849.88四君子湯高劑量組2.0 g/L3.337.9210.21四君子湯中劑量組1.0 g/L0.451.172.97四君子湯低劑量組0.1 g/L0.050.080.12

2.2 各組TNBC細胞MDA-MB-231凋亡率對比

空白對照組、紫杉醇組、四君子湯高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)組的MDA-MB-231凋亡率依次是12.23%、21.40%、24.25%、16.90%、15.37%。與空白對照組對比，四君子湯高劑量組細胞凋亡率顯著增加，差別有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

A.空白細胞組；B.四君子湯低劑量組；C.四君子湯中劑量組；D.四君子湯高劑量組；E.紫杉醇組圖1 藥物處理48 h后各組TNBC細胞MDA-MB-231凋亡率

2.3 各組TNBC細胞MDA-MB-231中PD-L1表達對比

與空白對照組對比，四君子湯高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1g/L)組PD-L1表達量均有所降低，其中四君子湯高劑量組較之差別有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

與空白對照組對比，*P<0.05圖2 藥物處理48 h后各組TNBC細胞MDA-MB-231中PD-L1表達

3 討 論

三陰性乳腺癌由于具有特殊的免疫表型，對大多數內分泌治療及針對HER2過表達、雌孕激素受體表達陽性的乳腺癌的靶向治療不敏感，目前臨床以化療為主，5年生存率<15%，預后較其他類型乳腺癌差[5]。免疫逃逸是腫瘤細胞逃避機體殺傷作用的重要途徑。和正常人相比，腫瘤患者外周血單核細胞的CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞的數量均會減少，同時，這些免疫細胞的功能和活性也會下降，例如細胞毒活性、細胞因子的分泌，以及抗原加工與提呈細胞能力。隨著腫瘤的動態發展，免疫細胞的特殊成分和性質發生高強度的動態變化而形成的腫瘤微環境會不斷變化[6]。越來越多的研究證明，免疫逃逸相關分子對判斷TNBC的預后和預測其治療靶標有重要作用。腫瘤浸潤淋巴細胞作為免疫逃逸的重要參與者，其表面的CD4/CD8比例變化對TNBC預后有指導價值[7]。TNBC中免疫抑制性代謝物吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO1)的表達能較好反應腫瘤的突變量，阻斷IDO1通路可能成為該病有效的治療途徑[8]；跨膜粘蛋白MUC1能夠作用于NF-κB及CD8+T細胞等途徑抑制TNBC細胞表面PD-L1的表達[9]。這些最新研究均提示免疫逃逸分子在TNBC靶向治療中的重要意義。筆者前期研究發現，TNBC細胞系中PD-L1高表達，降低PD-L1的表達能夠增加乳腺癌耐藥細胞的藥物敏感性。現在越來越多的實驗研究表明，中藥可以干預乳腺癌的免疫效應。

現代醫學表明，健脾補腎方、疏肝健脾方等能夠影響IFN-γ、IL-2、TGF-β，以及腫瘤細胞的凋亡，CD8+T細胞、CD4+T細胞、Treg等淋巴細胞的分化，對抑制腫瘤細胞免疫耐受有明顯作用[10-11]。徐川等的研究顯示，益氣健脾方能夠對乳腺癌免疫耐受有較好的改善作用[12]。以上研究表明，益氣健脾在本質上和西醫學降低腫瘤細胞免疫逃逸、提高機體免疫力的認識是一致的。健脾益氣方四君子湯由人參、白術、茯苓、甘草組成，具有補益氣血、益氣健脾之功效。方中人參為君，甘溫益氣，健脾養胃。臣以苦溫之白術，健脾燥濕，加強益氣助運之力。佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術相配，則健脾祛濕之功益著。使以炙甘草，益氣和中，調和諸藥。四藥配伍，共奏益氣健脾之效。最新研究發現：四君子湯中君藥人參能夠抑制乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長，能促進乳腺癌細胞凋亡[13-14]，對免疫器官、免疫細胞及免疫因子均有調控作用[15]，并能夠抑制PD-L1的表達[16]。本研究中，四君子湯雖然對三陰性乳腺癌細胞增殖沒有明顯的抑制作用，但是流式細胞術檢測表明，高劑量四君子湯具有能夠誘導三陰性乳腺癌細胞凋亡的作用。

此外，本研究觀察了不同劑量的四君子湯對三陰性乳腺癌細胞中PD-L1表達的影響，結果顯示：四君子湯高、中、低劑量組PD-L1表達量均有所降低。PD-1是TNBC發生免疫逃逸的重要參與者，以PD-1和其配體PD-L1為阻斷靶點是TNBC免疫治療領域的重要突破。通過應用PD-1/PD-L1抑制劑，能夠逆轉腫瘤細胞免疫逃逸的發生，增強機體免疫力。有研究表明，在乳腺癌小鼠模型及乳腺癌患者中，應用PD-1抑制劑顯示了較好的抗腫瘤活性[17-18]。因此，TNBC在目前缺少明顯的靶向藥物和化療耐藥的情況下，以增強和調控患者免疫功能的免疫療法具有潛力。本研究為進一步研究中醫藥治療TNBC的作用機制、探索TNBC的靶向治療奠定了實驗基礎。