超濾-納濾聯合用于川貝母生物堿的濃縮工藝

駱靈敏，鄭敏霞

0 引言

川貝母(FritillariaeCirrhosaeBulbus)來源于百合科(Liliaceae)植物貝母屬(FritillariesL.)中多種植物的鱗莖，經曬干或低溫干燥制得[1]。川貝母性苦、甘，微寒，歸肺、心經，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咳痰帶血等[2]，是四川最具代表性的道地藥材之一[3]。川貝母中的主要活性組分為生物堿，包括西貝母堿、川貝堿和西貝素等等[4-6]。目前已見報道的川貝母生物堿類活性成分的提取方法主要有乙醇滲濾法[7]、氨水浸提法[8]、酸水浸提法[9]等，雖然提取過程有效提高了川貝母生物堿的提取效率，但是由于西貝母堿不耐光熱，在濃縮和干燥過程中，均出現了含量下降的問題。膜分離技術在制藥行業中應用日趨廣泛，其中納濾技術具有無熱效應、能耗低等優點[10-11]，超濾可以選擇性地去除大分子雜質，有效保留小分子目標成分。以上兩種膜組件串聯在中藥行業中的應用尚處于摸索階段[12]。本文采用響應面法，以西貝母堿為研究指標，探討了超濾-納濾聯用優化川貝母生物堿的納濾濃縮參數，建立了含有熱敏性小分子活性組分的中藥濃縮范例。

1 儀器與材料

TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。聚醚砜納濾膜，截留相對分子量100、500、1 000，購自杭州科百特過濾器材有限公司；聚偏氟乙烯超濾膜，截留相對分子質量10 000、50 000、100 000，購自杭州科百特過濾器材有限公司。

川貝母飲片購自浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，并經朱濤副主任中藥師進行生藥學鑒定。西貝母堿對照品(批號：110767-201710)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(Tedia公司)，溴化鉀為光譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純(浙江三鷹化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 川貝母提取液制備[13]取川貝母藥材20 g，加入14倍量(重量/體積)65%乙醇滲濾7 h，滲濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2 考察指標的檢測

2.2.1 西貝母堿[1]標準曲線的制備：取西貝母堿對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成每l ml含0.2 mg的對照品溶液。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 ml，分別加三氯甲烷至10.0 ml、水5 ml、0.05%溴甲酚綠緩沖液2 ml，振搖，放置分層。取三氯甲烷液，過濾，取續濾液在415 nm的波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標、濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：A=0.036 90 C-0.022 75，R2=0.994 7(n=5)，結果表明，西貝母堿質量濃度在2.0～20.0 μg/ml范圍內吸光度呈良好的線性關系。

樣品測定：取“2.1”項下提取液稀釋一定倍數，加濃氨試液3 ml，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液(以下簡稱“混合溶液”)40 ml，80 ℃水浴回流2 h，濾過，濾液加混合溶液定容至50 ml，搖勻。精密量取2～5 ml，于水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 ml使溶解，照上述方法，測定吸光度計算，即得。

2.2.2 總蛋白[14]按BCA蛋白質濃度測定法，使用相關試劑盒測定供試樣品中蛋白質濃度。

2.3 超濾去除大分子 為達到提高納濾分離的效率、降低膜過濾系統的污染等目的，我們采用超濾法去除川貝母提取液中的蛋白質等大分子。取“2.1”項下的川貝母提取液，分別依次通過截留相對分子量為100 000、50 000、10 000的超濾膜，以西貝母堿和總蛋白質含量的動態變化情況為評價指標，對超濾過程的工藝參數進行篩選。

2.4 納濾分離單因素考察 參照川貝母生物堿分子量等相關參數，我們選擇截留相對分子量為450的納濾膜進行單因素考察及后續研究。取川貝母超濾液(1 L)置于納濾裝置中循環一定體積后，進行納濾，待納濾過程完成后，即得納濾液。

為了考察膜吸附對于川貝母中西貝母堿等生物堿類成分是否會產生破壞，同時確定納濾工藝參數，以西貝母堿含量變化情況為評價指標，選擇藥液循環體積、溶液溫度、納濾壓力3個關鍵因素進行單因素考察，具體參數見表1。

表1 單因素考察參數

2.5 透過率和截留率計算 分別精密吸取納濾(或超濾)工藝中的平衡液、納濾液(或超濾液)，按“2.2”項下的測定方法，測定待測成分的濃度，透過率(T)、截留率(R)計算公式為：T=C1/C2×100%，R=(1-C1/C2)×100%，其中，C1為納濾液(或超濾液)中待測成分的質量濃度，C2為平衡液中待測成分的質量濃度。

2.6 Box-Behnken響應面法試驗設計 在納濾工藝參數單因素考察的基礎上，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應面法試驗的設計及結果分析。我們選擇在納濾膜分離純化過程中，對結果影響最關鍵的3個因素：納濾膜截留相對分子量、西貝母堿濃度、溶液pH值作為響應面實驗的自變量，分別以-1、0、1代表自變量的變化水平，試驗因素水平表見表2。

表2 納濾濃縮響應面法考察因素水平表

3 結果

3.1 超濾大分子去除結果 不同截留相對分子量濾膜對川貝母提取液中生物堿類成分和蛋白質類成分的分離情況見表3。

表3 不同截留相對分子量的超濾膜對生物堿類成分和蛋白質類成分的分離情況

西貝母堿的相對分子量為429.6，在所有超濾分離試驗中的透過率均達到98%以上，幾乎沒有損失。總蛋白的透過率結果說明，超濾技術可有效去除川貝母提取液中的蛋白質類成分，當使用截留相對分子量為10 000的超濾膜時，幾乎可以將提取液中的蛋白質類成分全部去除；但去除的效果隨著截留相對分子量的增大逐步下降。出于保留川貝母提取液中有效成分和去除大分子物質兩者綜合考慮，我們選擇截留相對分子量為10 000的超濾膜，用于超濾分離過程。

3.2 納濾單因素考察結果

3.2.1 藥液循環體積考察 在進行納濾濃縮時，部分西貝母堿會吸附在納濾膜表面，同時已經吸附的成分會從納濾膜上解吸附下來，隨著藥液和納濾膜接觸的增加，吸附和解吸附速率逐漸相等，達到平衡。藥液循環體積因素考察結果見表4，可知納濾膜對西貝母堿的透過率產生了明顯的吸附作用，隨著循環體積的不斷增加，西貝母堿的透過率逐漸降低，當循環體積為4 L時，透過率趨于穩定，說明此時吸附速率和解吸附速率相同，達到平衡狀態。

表4 藥液循環體積對西貝母堿截留率的影響

3.2.2 溶液溫度考察 根據納濾膜供應商提供的濾膜參數，結合川貝母中生物堿的穩定性情況，納濾時的最高溶液溫度應小于50 ℃，考察結果見表5。可知隨溶液溫度的上升，西貝母堿的截留率顯著下降，同時可觀察到膜通量相應增加。其中，5 ℃時納濾膜對生物堿類成分的截留率最高，20 ℃時截留率略微下降，但與5 ℃結果比較差異無統計學意義。據結果推測，隨著溶液溫度的上升，上述有效成分在納濾膜中的擴散系數增大，擴散加劇，從而更易通過納濾膜，使截留率下降。

表5 溶液溫度對西貝母堿截留率的影響

3.2.3 操作壓力考察 操作壓力直接影響納濾濃縮的效率，操作壓力越高，膜通量越大。操作壓力考察結果見表6。隨著操作壓力的升高，西貝母堿的截留率呈現出一定程度的升高，當操作壓力為1.5 MPa時，截留率最高。

表6 操作溫度對西貝母堿截留率的影響

3.3 響應面法優化納濾工藝參數 在單因素試驗結果基礎上，我們選擇的循環體積為8 L、溶液溫度為20 ℃、操作壓力為1.0 MPa，充分發揮納濾系統的濃縮能力，提高實驗結果的準確；每組試驗平行進行3次，用截留率的平均值進行后續分析，確保試驗的穩定性。試驗設計及結果見表7，方差分析結果見表8。

表7 納濾濃縮過程的響應面設計結果

表8 納濾濃縮過程響應曲面二次回歸模型的方差分析

3.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗 使用Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗結果擬合分析，得到西貝母堿對上述3個自變量的二元回歸方程：西貝母堿截留率Y=92.52+6.73A+12.86B+6.79C+3.5AB-0.17AC+2.25BC-6.29A2-19.27B2-13.7C2。由該模型的方差分析可知，F值為43.49，P<0.000 1，說明該模型顯著；3個自變量對西貝母堿的截留結果影響的順序為B>C≈A，相關系數R2=0.982 4，預測R2=0.967 8，調整R2=0.979 8，說明模型的擬合結果理想。綜上所述，該模型十分顯著，可有效進行響應值的預測，實驗設計方案科學合理。

3.3.2 納濾過程條件的響應面分析與優化 用“3.3.1”項下的回歸方程作圖，得到圖1。由圖1可知，3個自變量對于西貝母堿的截留情況均有不同程度的影響，其中對于截留情況影響最大的是超濾液濃度。隨著藥液濃度的升高，西貝母堿的截留率先提高，達到最高點后開始下降，對應的響應曲面斜率變化最大，說明在納濾濃縮過程中，西貝母堿濃度的影響占主導地位。pH值對截留情況具有一定程度的影響，當超濾液pH值從堿性變為酸性，生物堿類活性成分逐漸離子化成為鹽，由于納濾膜荷負電，生物堿類成分的陽離子鹽因為靜電引力更難通過納濾膜的孔隙[15-16]，使截留率提高；但過低的pH值會影響濾膜的穩定性，從而使截留率降低。納濾膜孔徑對于截留情況具有一定程度的影響，響應曲面較為平緩。雖然納濾膜截留相對分子量跨度較大(100～1 000)，但是由于超濾液濃度及pH值的影響，使西貝母堿難于通過納濾膜，部分抵消了納濾膜孔徑變化對截留率的影響。

根據Design-Expert 8.0.6軟件對結果的優化分析，通過提高截留率來提高膜分離效果，得到的西貝母堿納濾工藝最優工藝參數為：截留相對分子量為710、西貝母堿質量濃度為243 μg/ml、超濾液pH為5.3；西貝母堿的截留率預測值為93.80%。考慮到實際操作的簡便性和可行性，對上述參數進行調整，選定的最佳參數為截留相對分子量為500、西貝母堿質量濃度為140 μg/ml、超濾液pH為5.5。

以最優工藝參數為基礎，進行驗證試驗，西貝母堿實際截留率為93.57%(n=3)，相對偏差為0.25%，說明預測結果和實測結果間偏差小，模型的預測結果準確可信。

4 討論

加熱濃縮是中藥制劑濃縮最常用的技術手段，唐代即有關于煎煮濃縮的記載，具有簡便易行、設備要求低、技術成熟等優點。但加熱濃縮過程因條件較為劇烈，常出現氧化、聚合及美拉德反應，使部分熱敏性及穩定性差的活性成分遭到破壞，一定程度上限制了加熱濃縮手段的應用；此外，加熱濃縮能源消耗大，能源利用效率低，不符合國家綠色化學、綠色工業的倡議。超濾過程不產生熱量，濃縮效率高，能源利用效率高，很好地解決上述問題，特別適用于以西貝母堿為代表的生物堿類活性成分(生物堿類成分通常穩定性較差)的濃縮，為此類成分的濃縮提供了一種全新的技術路徑。

圖1 截留相對分子量、西貝母堿質量濃度及pH對西貝母堿納濾結果的影響

隨著全新功能型新材料的開發，濾膜在強度、化學成分定性及孔徑的可控性方面有了顯著的提升，膜分離技術也日益成熟，受到學界的關注。膜分離技術具備分離參數易控、重現性好、易于工業端的放大轉化等優點，具有良好的產業化基礎。雖然以聚四氟乙烯濾膜為代表的新型濾膜的應用已非常成熟，但由于其造價高、應用與水相系統前需要用異丙醇浸潤，在增加了分離成本的同時，也存在引入污染物的風險。因此,在進行膜分離研究時，需要充分、全面地評估待分離組分，對體系內各組分的化學特性進行充分的評估，以選擇適宜材質的濾膜。