高活性漆酶菌株 6BS篩選及其對染料脫色的影響

劉 學， 王金家， 王艷杰， 于文浩， 邢鑫蕊， 汪春蕾

(東北林業大學 生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

漆酶是屬于藍色多銅氧化酶家族的多酚氧化酶[1]。其能通過氧氣氧化一些芳香族化合物，同時將分子氧還原為水[2-3]。漆酶在自然界中普遍存在[4]。其中，細菌和真菌漆酶的應用價值較大，在紙漿造紙、污水處理、木材加工、能源、環保、生物合成領域均有重要應用[5]。

據統計，世界上的染料至少10%排放到水體中[6]，其組分復雜、有機物含量高、難降解且毒性強[7]，不僅對水生動植物造成危害，還對人體健康產生嚴重危害。目前，處理染料廢水的方法主要有3種。物理法和化學法具有成本高昂[8]、廢液處理不徹底的缺點[9]，而生物法則具有效率高、能耗低、投資少和環境友好等特點，成為了近年來研究的熱點。

細菌漆酶具有較多的優點，如熱穩定性較強，pH適應性較廣，對NaCl和一定濃度的多種有機溶劑具有較強的耐受性[10]，因此在印染廢水的染料脫色處理中起重大作用。但當染料底物的氧化還原電勢比漆酶高或底物太大以致無法接近漆酶的催化位點時，介體與漆酶組成的漆酶介體系統可協助漆酶完成反應，介體因結構的不同而通過電子傳遞、氫原子傳遞或離子氧化而起作用[11]。

為尋找可用于染料廢水生物處理的高效菌株，特從東北林業大學實驗林場的土壤中分離、篩選出1株具有較高漆酶活性的菌株，對該菌株進行鑒定，研究該菌株的生理、生長特性，并研究不同類型介體對芽孢漆酶脫色偶氮、蒽醌、靛藍及三苯甲烷類染料的影響，以期為工業染料廢水的處理提供優良菌株和理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品樣品土壤取自東北林業大學實驗林場。

1.1.2主要試劑Taq DNA Polymerase、EescherichiacoliJM109感受態細胞和細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司，DNA Marker DL2000、dNTP(2.5 mmol/L)、pMD18-T載體購自TaKaRa公司，16S rDNA通用引物27F和1492R由華大基因公司合成。丁香醛連氮、結晶紫、靛紅、活性黑和RBBR均購自Sigma公司，細菌微量生化反應管購自杭州濱和微生物試劑有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2產漆酶菌株的篩選及純化

用Cu2+為篩選劑純化出單克隆菌株，并以丁香醛連氮為底物，篩選出顏色呈深紅色且具有較高漆酶活性的菌株[12]。

1.3菌株的形態學觀察及生理生化特性測定

對菌體進行革蘭氏染色并觀察其形態，并利用生理生化反應管測定其糖類發酵等生理生化反應特性[13]。

1.4菌株的16S rDNA基因克隆及系統發育樹的構建

參照細菌基因組DNA提取試劑盒上提取方法提取細菌總DNA。利用細菌的通用底物27F，5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ (M=A+C)和1 492R，5′-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3′

(Y=C+T)[14]克隆菌株的16S rDNA基因。PCR反應體系：滅菌蒸餾水7.7 μL，10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.6 μL，2.5 μmol/L的引物各4 μL，DNA模板0.5 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，加ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：93℃預變性5 min；94℃變性18 s，56℃退火15 s，72℃延伸78 s，30個循環；72℃延伸7 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測。

用B型小量DNA片段膠回收試劑盒回收PCR產物，將膠回收產物與pMD18-T連接，將連接產物轉化到E.coliJM109感受態細胞中，37℃培養40 min后，將菌液涂布含有氨芐青霉素的平板上，37℃培養過夜。將菌落PCR鑒定為陽性的轉化子送到華大基因有限公司進行16S rDNA測序。測定結果在NCBI的BLAST上進行比對，利用Clustalx軟件進行多序列比對，通過Phylip-3.69軟件中最大簡約法構建該菌株的系統發育樹[15]。

1.5菌株的生物學特性分析

研究溫度(20～50℃)、pH(3～10)、NaCl質量分數(1%～10%)、銅離子濃度(0～6 mmol/L)對菌株生長的影響(表1)。菌株在LB培養基中活化后，按2%接種量接種于不同條件的LB液體培養基中，基本培養條件為30℃，120 r/min培養12 h，測其OD600nm值，3次重復，取平均值。

表1菌株生物學特性的分析條件

1.6不同介體對菌株的芽孢漆酶脫色染料的影響

菌株芽孢漆酶液的制備方法參考文獻[16]，染料脫色體系包括0.1 mmol/L介體、染料、1 mg/mL芽孢漆酶液以及0.1 mol/L、pH=7.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。所用的介體為乙酰丁香酮(AS)、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和丁香醛(SA)。所用的染料為雷馬素亮藍R(RBBR)、活性黑、靛紅和結晶紫，染料的類型、終濃度及最大吸收波長見表2。并設不加介體的染料脫色對照組。40℃，160 r/min脫色2 h、4 h和6 h后分別取樣，14 000 r/min離心2 min后，用分光光度計測定各種染料最大吸收波長處的吸光值，重復測定3次，取平均值計算染料的脫色率，脫色率(%)=(A0-A)/A0×100%。式中，A0為初始染料吸光值，A為不同時間取樣時測的吸光值。

表2染料類型、終濃度及最大吸收波長

Table 2 Type, final concentration and maximum absorption wavelength of four dyes

染料名稱Dye name染料類型Dye type終濃度/(mg/L)Final concentration最大吸收波長/nmMaximum absorption wavelengthRBBR蒽醌100591活性黑 Reactive black偶氮40597靛紅 Isatin靛藍25610結晶紫 Crystal violet三苯甲烷5583

1.7數據處理

利用Excel計算3次重復數據的染料脫色率、脫色率的平均值和標準差，并利用SPSS軟件對不同介體對染料脫色率的影響進行顯著性分析(P<0.05)。

2結果與分析

2.1具有漆酶活性菌株的篩選及分離

經篩選對丁香醛連氮顯深紅色的編號為6BS的菌株進行后續研究。

2.2菌株6BS 的形態學觀察及生理生化特性

菌株6BS在LB固體培養基上37℃培養24 h，菌落乳白色，較小，圓形不透明，表面干燥，質地粗糙，菌落邊緣呈現羽毛狀，革蘭氏染色呈藍紫色，短桿狀，為革蘭氏陽性細菌。菌株6BS能利用甘露糖、蔗糖和葡萄糖作為碳源，不能利用阿拉伯糖、蜜二糖、木糖醇、山梨醇和枸櫞酸鹽，不產生精氨酸雙水解酶，菌株6BS屬于發酵型菌株。

2.3菌株6BS 的16S rDNA基因克隆及構建系統發育樹

菌株6BS的16S rDNA基因經克隆后測序共1 513 bp，在GenBank上提交序列獲得注冊號為MH127533。經比對該菌株與多種芽孢桿菌的同源性達99%。結合菌株6BS形態學、生理生化特性以及16S rDNA同源性比對結果，鑒定該菌株為芽孢桿菌屬細菌，命名為Bacillussp. 6BS。由圖1可見，系統發育樹中菌株6BS與Bacillussubtilis關系最近。

圖1基于16S rDNA序列菌株6BS 的系統進化樹

2.4菌株6BS 的生物學特性

菌株6BS的最適生長溫度為37℃，在20～50℃均能生長(圖2A)，最適生長pH為8.0，在pH5.0～9.0長勢很好(圖2B)，菌株6BS在含1%～2%NaCl的培養基中生長旺盛，能夠耐受5%的NaCl(圖2C)，菌株6BS對Cu2+的耐受性較強，小于0.4 mmol/L的Cu2+對菌株生長無影響，其能耐受2 mmol/L的Cu2+(圖2D)。

圖2不同條件下菌株6BS 生長的OD值

2.5不同介體對菌株6BS 芽孢漆酶脫色染料的反應

不加介體的條件下脫色6 h，菌株6BS的芽孢漆酶對三苯甲烷類染料結晶紫(圖3A)和蒽醌類染料雷馬素亮藍R(圖3B)的脫色率較高，分別達到92.12%和70.64%。與不加介體的對照組相比，介體乙酰丁香酮能顯著提高芽孢漆酶對靛藍類染料靛紅，偶氮類染料活性黑和蒽醌類染料雷馬素亮藍R的脫色率，介體2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物能顯著提高芽孢漆酶對雷馬素亮藍R、靛紅和活性黑的脫色率，丁香醛能顯著提高芽孢漆酶對靛紅和活性黑的脫色率(圖3C、D)。乙酰丁香酮、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和丁香醛這3種介體對結晶紫脫色率無顯著影響，表明芽孢漆酶對結晶紫的脫色機制與其他3種染料不同。

注：結晶紫(A)、RBBR(B)、靛紅(C)和活性黑(D)的影響，不同小寫字母表示不同介體的影響在0.05水平上差異顯著。

Note: A, Crystal violet; B, RBBR black; C, Isatin; D, Reactive. Different lowercase letters indicate significance of difference atP< 0.05 level.

圖3不同介體對菌株6BS芽孢漆酶脫色染料的反應

Fig.3 Response of different mediators to dye decolorization by spore laccase of strain 6BS

3結論與討論

菌株6BS具有耐銅性，能耐受2 mmol/L的Cu2+，易于分離和篩選，與菌株4BS的耐銅特性相似[17]，均優于菌株CLb[18]、菌株WD23[19]和菌株9BS[20]對Cu2+的耐受性。Cu2+是漆酶催化中心的輔助因子，對于漆酶表達后的折疊與組裝起重要作用，Cu2+能提高漆酶活性，是漆酶活性必須的輔助因子[17]。菌株6BS耐銅性對其應用于廢水治理有重要意義。

本研究中，芽孢漆酶位于菌體的芽孢中，芽孢漆酶對染料的脫色是菌體和芽孢漆酶共同作用的結果。細菌表面具有各種活性基團能夠吸附染料，細胞壁和細胞膜等組分也對染料有吸附能力[21]。芽孢漆酶可以通過O2催化多酚類物質，因大多數染料分子中含有酚類結構單元，故可被脫色[22]。但漆酶對一些染料的脫色效果較差，引入介體后，漆酶提高染料的脫色效率。漆酶氧化還原電勢低是限制漆酶活性的主要因素，而且也不能直接作用于高氧化還原電勢的底物。介體其實是一些分子量低、低氧化還原電勢的化合物，在漆酶的作用下易得失電子形成活性高且穩定的中間體，并作用于底物，使其被氧化[23]。本研究中，菌株6BS的芽孢漆酶對三苯甲烷類染料結晶紫的脫色率較高，加入3種介體后，并無顯著提高芽孢漆酶對結晶紫的脫色率，表明芽孢漆酶對結晶紫的脫色主要是菌體的吸附作用，結晶紫的氧化還原電勢低，加入介體也未能增加其脫色效果。而加入介體乙酰丁香酮和2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物均能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對靛紅、活性黑和雷馬素亮藍R的脫色率，加入介體丁香醛能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對靛紅和活性黑的脫色率。介體共分為3類，有天然介體如乙酰丁香酮和丁香醛、合成介體如2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和其他類介體。天然介體不僅來源易、花費少且對環境友好[24]。在本研究中天然介體AS有顯著作用，是染料脫色中值得推薦的介體。

該研究結果表明：以Cu2+為篩選劑，以丁香醛連氮為底物，篩選出具有較高漆酶活性的菌株6BS，鑒定其為芽孢桿菌屬的細菌，故命名為Bacillussp. 6BS。菌株6BS能耐受5%NaCl和2 mmol/L Cu2+。天然介質乙酰丁香酮、丁香醛，合成介質2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物2種介體均能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對靛紅和活性黑的脫色率。