艷山姜風味發酵酒工藝條件的優化

黃 彭， 伍 瓊， 馮瑞章， 楊胡艷， 彭顯清， 董守超， 魏 琴*

(1.宜賓學院 固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000)

艷山姜[Alpiniazerumbet(Pers) Burttet Smith]是集藥用、食用、觀賞和水土保持于一體的多年從生草本植物[1-4]。其精油中富含樟腦(camphor)、香檜烯(sabinene)、γ-松油烯(γ-terpinene)、松油烯-4-醇、α-蒎烯(α-pinene)、石竹烯氧化物(caryophyllene oxide)等功能活性成分[5]，具有降壓、降脂、降低竇性心律和降低心肌肥厚等作用[6-8]。此外，艷山姜還含有黃酮類、酚類、吡喃酮類、二萜類和有機酸類等物質，具有抗菌、抗氧化、鎮痛抗炎、調節神經系統等多種生物活性[9-10]，具有較好的經濟開發價值。因此，艷山姜在我國東南部至西南部均有分布和種植，產量較高，資源豐富，但由于目前規模較大，生產管理粗放，上市時間較集中；加之基礎性研究薄弱，產品開發單一，產業鏈短小，嚴重影響種植者的收益和積極性。

保健型飲料酒主要是用高度白酒或食用酒精浸泡而成，原料中很多營養和風味物質不能充分進入酒中。隨著微生物技術的快速發展，人民健康意識的提高，浸泡型保健飲料逐步向低度發酵型保健酒轉變，通過微生物的代謝過程，能將原料中的一些營養、功能性物質經發酵后保留在液體中，從而提高產品的營養價值[11]。筆者等以艷山姜果實為原料，在單因素試驗基礎上，篩選出對發酵工藝影響較大的因素進行正交優化試驗，以期為艷山姜風味發酵酒的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 艷山姜，采自宜賓市屏山縣八一專業合作社。安琪活性干酵母(RH、EC1118、DV10、QA23、果酒酵母)，湖北安琪活性干酵母有限公司生產；酵母菌Z9Y-91、S432Y-42，由宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室提供。

1.1.2 試劑 葡萄糖、明膠、檸檬酸、酵母膏，為食品級；氫氧化鈉、亞硫酸、鹽酸等試劑，均為分析純；白砂糖，市售。

1.1.3 儀器與設備 LG10-2.4A型高速離心機，北京中興偉業儀器有限公司；303A型電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；生化培養箱，上?？茖W儀器廠；PHS-3B型精密pH計，上海雷諾儀器廠；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；酒精計，上海雷諾儀器廠；CNT95數字折射計，杭州路恒生物科技有限公司。

1.2 工藝流程及操作要點

1.2.1 工藝流程 菌種篩選→菌種活化→原料篩選→粉碎、過篩→發酵液制備→主發酵→后發酵→陳釀→澄清過濾→灌裝→成品。

1.2.2 操作要點

1) 原料。挑選色澤純正、無變質，風味濃厚的生曬艷山姜果實。

2) 粉碎。艷山姜果實經恒溫鼓風干燥箱55℃干燥5 h后，經粉碎機粉碎，過40目篩備用。

3) 酵母活化。稱取所需質量活性干酵母，將其加入到35～38℃、4%蔗糖溶液中，干酵母與糖水質量比為1∶10(即活性干酵母添加量為10%)，不斷攪拌混勻，恒溫水浴20～30 min活化酵母。

4) 發酵液制備。因艷山姜果實總糖含量少，在試驗中忽略不計。釀造酒精度為12%的艷山姜風味發酵酒(按17.5 g/L蔗糖經酵母發酵產生酒精度1%來添加蔗糖)，用0.8%檸檬酸調節發酵液的pH，加入原料制成發酵液。

5) 主發酵。將發酵液放入發酵罐，接種活化好的酵母，以料液比、酵母接種量、起始pH、主發酵溫度和主發酵周期等5個因素分別進行單因素試驗。發酵結束后，測定發酵醪液的酒精度并進行感官評分，以確定發酵的最佳單因素條件后，通過L9(34)正交試驗確定最佳工藝組合。

6) 后發酵。主發酵結束后，用多層紗布過濾，分離發酵瓶底部大量的沉淀與汁液，將汁液保持在15～20℃條件下進行后發酵20 d。

7) 陳釀、澄清、過濾。后發酵結束后進入陳釀期，陳釀溫度控制在15℃以下，密閉放置20 d，再采用0.05%明膠澄清酒液。最后用2 μm濾膜過濾艷山姜風味發酵酒，除去大分子顆粒物質、酵母菌及其他微生物，使酒質更加柔和，保存時間更長。

1.3 優勢菌種的篩選

從果酒酵母、安琪活性干酵母RH、QA23、EC1118、S432Y-42、DV10和Z9Y-91共7株酵母中篩選艷山姜風味發酵酒發酵的優勢菌種。優勢菌種篩選試驗采取小容器發酵，發酵容器為150 mL的玻璃三角瓶，蔗糖水調至可溶性固形物為20%，原料添加量為1%，分別量取100 mL醪液于7個發酵瓶中，酵母添加量為0.4%，在30℃條件下恒溫發酵7 d，以發酵體系中的酒精度和感官評分為評價指標，篩選出最適宜艷山姜發酵的菌種。

1.4 發酵工藝單因素試驗

在發酵過程中分別以料液比、主發酵溫度[12]、起始pH、酵母添加量[13]、發酵周期為單一變量設計單因素試驗。當料液比為0%、2%、4%、8%、16%時，固定條件為酵母接種量4%、主發酵溫度30℃、起始pH 4.0、培養時間7 d，檢測酒精度并進行感官品評，篩選適宜的料液比；在此基礎上，以主發酵溫度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃進行試驗，固定起始pH 4.0、酵母接種量4%、培養時間7 d，篩選適宜的發酵溫度；以起始pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，固定條件為酵母接種量4%、培養時間7 d，篩選適宜的起始pH；以酵母接種量為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，固定條件為培養時間7 d，篩選適宜的酵母接種量；最后以主發酵周期為3 d、7 d、11 d、15 d、19 d，篩選適宜的發酵周期[14-18]。

1.5 發酵工藝正交試驗

根據單因素試驗，選取對艷山姜風味發酵酒工藝影響較大的主發酵溫度、起始pH、菌種添加量、料液比進行L9(34)正交試驗(表1)，以成品酒的酒精度、感官評分為衡量指標，對發酵工藝參數進行優選[19]。并將優化的最佳發酵條件進行3組平行驗證試驗。

表1 艷山姜風味發酵酒工藝正交試驗的因素及水平

1.6 指標測定方法

酒精度用酒精計法測定，參照國標GB/T 15038-2006；糖度用DNS法；總酸度用指示劑法，參照國標GB/T 15038-2006；pH用pH計法。

1.7 感官評定與綜合評價

對成品酒進行感官評價，綜合確定發酵的參數和發酵的程度，使成品更符合消費者的需求，根據GB 15038-2006和文獻[20-21]的感官評價方法制定評分標準(表2)，選擇10位食品專業學生進行感官品評，評定結果為10人的平均分。以酒精度和感官評分各50%的權重進行綜合評價。

表2成品酒的感官評價項目及評分標準

Table 2 Sensory evaluation items and scoring standard ofA.zerumbetflavor fermented wine

1.8 數據處理

試驗數據用EXCEL 2010軟件和SPSS軟件的Duncan法進行處理。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

從表3可知，在7種酵母菌中起酵速度為RH>QA23>EC1118>S432Y-42>果酒酵母>DV10>Z9Y-91；安琪活性干酵母RH發酵的酒精度最高，達6.26%，且酒體金黃，口感醇厚，典型性良好，感官評分為(81.67±1.53)分。綜合發酵速度、酒精度和感官評分，以安琪活性干酵母RH作為艷山姜風味發酵酒的優勢菌株。

表3不同菌種發酵艷山姜風味酒的酒精度和感官評分

Table 3 Alcoholic strength and sensory score of different yeast strains forA.zerumbetflavor fermented wine

2.2 不同發酵因素艷山姜風味發酵酒的品質

從圖1可看出不同發酵因素對艷山姜風味發酵酒品質的影響。

2.2.1 料液比 以5種料液比進行艷山姜風味發酵時，原料對酵母生長表現出明顯的抑制作用。原料添加過多會產生苦味，過少風味特征不足，影響口感，料液比為4%時感官評分最高。綜合酒精度和感官評分，以料液比4%為最適添加量。

圖1 不同發酵因素下艷山姜風味發酵酒的品質

2.2.2 主發酵溫度 溫度過低，酵母自身生長繁殖受到抑制，代謝能力降低，造成起酵慢且產酒效率低，產生的香味物質少。艷山姜風味發酵酒的酒精度、感官評分隨發酵溫度升高呈先上升后下降趨勢，當主發酵溫度為25℃時，酒精度、感官評分均最高，分別為3.22%和(79.0±1.63)分。

2.2.3 起始pH 當起始pH為4.0時，酒精度、感官評分最高，分別為3.63%和(82.33±2.05)分。同時發現，pH較高時，酒體顏色較深，品質下降，這可能是因為雜菌生長消耗營養物質，產生副代謝產物，酒精度和感官評分均下降。綜合考慮，艷山姜風味發酵酒的起始pH以4.0為宜。

2.2.4 菌種添加量 一般酵母添加量越大發酵越快，發酵周期縮短，但風味物質形成受到影響，所得發酵酒酒體粗糙，而且大量的酵母泥會影響產品風味；添加量減少，則發酵慢，殘糖量增多，風味寡淡，發酵酒的有效成分減少。綜合酒精度、感官評分和節約性考慮，艷山姜風味發酵酒的酵母接種量以1.0%最佳。

2.2.5 主發酵周期 隨著發酵周期延長艷山姜風味發酵酒的酒精度和感官品質上升，但時間過長酒精度增加緩慢，容易導致雜菌生長，使酒體酸度上升，產生酸澀味。從縮短生產周期、增大效益和感官評分考慮，艷山姜風味發酵酒的發酵周期以11 d為宜。

2.3 發酵工藝的優化

從表4可知，對艷山姜風味發酵酒酒精度的影響程度為B>A>C>D，對感官評分的影響程度為B>A>D>C。根據各指標不同水平平均值確定各因素的優化水平組合，其中，酒精度的較優方案為A3B2C1D3，感官評分的較優方案為A2B3C1D2，2個指標單獨分析的優化條件不一致，因此根據因素影響主次進行綜合分析。對于因素A、B，感官評分及對酒精度的影響均排第一位，確定為主要因素，當因素A取A2時，酒精度比取A3時高，但差異較小；取A3時，艷山姜風味發酵酒的醇溶性物質增多，風味特征較良好，因此，因素A取A3；同理，因素B取B2，因素C取C3，因素D取D1。艷山姜風味發酵酒發酵的最優方案為A3B2C3D1，即最佳發酵條件為料液比5%、發酵溫度25℃、起始pH為4.0和酵母添加量0.9%。

2.4 驗證試驗

從表5可知，經最佳發酵條件所得艷山姜風味發酵酒的酒精度、感官評分的RSD均小于2%，表明試驗有較好的重復性，感官評分和酒精度較高，平均為90.33分和9.46%，艷山姜風味發酵酒酒體透明、澄清、無懸浮物或沉淀物；色澤金黃、酒香協調柔和、香味濃郁；調和適當，無異雜味；風格良好，具有艷山姜的獨特風味。

表4 艷山姜風味發酵酒工藝的正交試驗結果

表5 最佳工藝重復性試驗結果

2.5 理化與質量指標

經測定，艷山姜風味發酵酒成品酒的總糖為(5.56±0.43)g/L、總酸為(4.80±0.24)g/L、酒精度為10.05%、感官評分為(90.67±2.08)分。細菌總數≤50 cfu/mL，大腸菌群≤30 MPN/100 mL，未檢測出致病菌，污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量分別符合GB 2762-2016、GB 2761-2016和GB 2758-2016規定。

3 小結

試驗結果表明，適宜艷山姜風味發酵酒的酵母為安琪活性干酵母RH，其發酵的最佳工藝條件為酵母添加量0.9%、料液比為5%、起始pH 4.0、主發酵溫度25℃、主發酵周期11 d。在此條件下，發酵的產品酒精度達10.05%，糖度為(5.56±0.43)g/L，酸度為(4.80±0.24)g/L，酒體澄清透明，色澤金黃，口感醇厚，具有艷山姜的特殊氣味，感官評分達(90.67±2.08)分。

艷山姜姜汁具有促進腸道蠕動和胃排空的功效[22-23]，艷山姜風味發酵酒是否也具備該功效，仍需經相關試驗論證。由于艷山姜本身含有大量功能活性物質，具有一定的抑菌作用，為了提高發酵效率，在酵母活化過程中添加少量艷山姜汁液進行菌種馴化，培育適宜艷山姜發酵液的高效菌株，再接種到發酵液中。本試驗僅對已有菌種進行篩選，未對強抗艷山姜抑菌的菌種選育，相關試驗還需進一步研究完善。