廈門地區低致病性禽流感病毒流行病學調查與分析

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禽流感病毒可以感染家禽、野禽甚至哺乳動物并致死，不僅給養殖業造成重大經濟損失，亦危害公共衛生安全,是重要的人獸共患病病原。目前禽流感病毒有18個H亞型(H1 -H18)及11個N亞型(N1-N11)，其中H1-H16亞型的流感病毒均可在水禽中分離到[1]，而H17和H18自蝙蝠中檢出[2]。野禽是禽流感病毒的天然宿主，并可通過遷徙，造成世界范圍的大流行；豬和水禽是禽流感病毒的混合器，可以同時感染多種不同亞型的流感病毒，并在其體內發生重組，產生新的亞型；家禽活禽市場是禽流感病毒的重要儲存庫，大量不同種屬、不同產地來源的禽類，高密度的集中在一起，加上管理和消毒不到位，造成禽流感病毒的長期存在及循環，并可借此途徑感染人。

禽流感病毒分為高致病性(High Pathogenic Avian Influenza Viruses, HPAIV)和低致病性(Low Pathogenic Avian Influenza Viruses，LPAIV)兩大類。高致病性禽流感因其在禽類中傳播速度快、危害大、致死率高，被世界動物衛生組織列為A類動物疫病，成為疫病防控的重點。而LPAIV感染家禽后癥狀不明顯，容易被忽視，因此得以長期、廣泛的分布，周而復始的循環及變異使其不斷適應當下養殖環境，進而演化成為具有耐藥性及跨種屬感染的新型毒株。有些低致病禽流感病毒如H7N9、H6N1、H10N8、H9N2，甚至可以突破宿主屏障感染人并致死[3-6]，存在著極大的安全隱患。因此只有同時加大對LPAIV的監測力度，掌握本地區家禽禽流感病毒的真實帶毒情況，才能科學有效的防控疫病。

1 材料與方法

1.1樣品來源 選取2016年11月至2017年3月采集的廈門主要幾家活禽交易市場的家禽喉、泄殖腔棉拭子及飼料、水等環境樣品進行禽流感的檢測及分型鑒定。同批次且相同來源的樣品為1個群，共采集75群，534份棉拭子，包括雞25群，265份；鴨24群，152份；環境26群，117份。

1.2樣品的保存與運輸 保存液PBS購自HyClone，頭孢西丁鈉購自致君(深圳)制藥有限公司，甘油(分析純)購自廈門綠茵試劑玻儀有限公司。PBS使用前，配置為頭孢西丁鈉濃度為0.2%、甘油濃度20%的工作液，分裝在2 mL的EP管中，用于樣品的保存。樣品采集后立即置于含冰塊的泡沫箱中，4 h內送實驗室檢測或-70 ℃保存，檢測過程中避免樣品的反復凍融。

1.3檢測試劑及儀器 HA禽流感病毒通用診斷試劑盒購自QIAGEN，H1-H16亞型及N1-N9亞型的分型診斷試劑盒購自碩世生物科技有限公司和深圳澳東檢驗檢測科技有限公司，核酸提取試劑(MagMAXTM-97Viral RNA)購自Thermo Fisher Scientific。熒光定量PCR儀(Cobas z 480)購自RoCho，全自動核酸提取儀購自瑞士TECAN。

1.4檢測及分型鑒定 待檢樣品經全自動核酸提取儀提取核酸后，用HA禽流感病毒通用診斷試劑盒對其進行檢測，檢測結果處于臨界值的可疑樣品，經重復檢測結果仍為可疑時判為陽性，用于禽流感病毒檢出率的統計。從檢出強陽性的群中，混合同群的強陽性核酸樣品，用亞型分型診斷試劑盒進一步進行H1-H16及N1-N9的分型鑒定，計算不同亞型病毒的群檢出率。

2 結 果

2.1禽流感病毒的檢出率 2016年11月至2017年3月，在本地幾家活禽交易市場共抽檢75個群534份樣品，檢出禽流感病毒陽性的群33群，陽性樣品216份，群陽性率為44.0%，樣品陽性率為40.4%。其中抽檢雞群25群265份樣品，檢出陽性的雞群15群，陽性樣品111份，雞群陽性率為60.0%，樣品陽性率為41.9%；抽檢鴨群24群152份樣品，檢出陽性的鴨群11群，陽性樣品65份，鴨群陽性率為45.8%，樣品陽性率為42.8%；抽檢環境群26群117份樣品，檢出陽性的環境群7群，陽性樣品40份，環境群陽性率為26.9%，樣品陽性率為34.2%，詳見表1。

表1 活禽交易市場禽流感病毒檢出率Tab.1 Detection rate of avian influenza virus in the live poultry market

2.2禽流感病毒亞型鑒定結果 從14個檢出強陽性的群中，鑒定出6種HA亞型，不同亞型病毒群檢出率由高到低依次為H9(100%,14/14)、H6(35.7%,5/14)、H11(28.6%,4/14)、H12(21.4%,3/14)、H1(14.3%,2/14)、H3(7.1%,1/14)；檢出5種NA亞型，不同亞型病毒群檢出率由高到低依次為N2(92.9%,13/14)、N6(42.9%,6/14)、N3(35.7%,5/14)、N8(28.6%,4/14)、N9(21.4%,3/14)；H9亞型,N2亞型檢出率特別高，詳見表2。

表2 活禽交易市場部分陽性樣本HA、NA亞型分型結果Tab.2 Results of HA and NA subtypes typing of parts of sample in live poultry market

2.3禽流感病毒混合感染情況 交易市場中環境樣品中可檢出多種亞型的禽流感病毒。雞群的混合感染不明顯，7個禽流感陽性的雞群中，有6個群體僅檢出H9N2亞型病毒，混合感染率為14.3%(1/7)；而鴨的混合感染情況較為嚴重，4個禽流感陽性的鴨群中有3個存在混合感染，混合感染率為75.0%(3/4)，并且均是3種亞型以上的混合感染；3個禽流感陽性的環境群中均同時4種亞型以上的病毒。

3 討 論

家禽的禽流感感染有很強的季節性，以冬季最高，春秋季次之，因此本研究選取2016年11月—2017年3月的時間段進行抽樣檢測，根據近幾年來廈門市禽流感監測結果，這5個月中禽流感檢出率最高。選擇活禽交易市場作為研究對象，是因為活禽交易市場是禽流感病毒的重要儲存庫，大量不同種屬、不同產地來源的禽類，高密度的集中在一起，加上管理和消毒不到位，易造成禽流感病毒的長期存在及循環，分離到的亞型會更豐富。目前尚未見到廈門市低致病性禽流感病毒亞型分型情況的報道，該研究彌補了數據的空白，為有效的防控提供科學依據。

研究亞型分型時，篩去檢測結果中弱陽性和臨界值的陽性樣品，選擇具有標準熒光曲線，Ct值小于30的陽性樣本進行檢測，有利于確保分型結果的準確性。結果提示該時期廈門市至少存在6種HA亞型和5種NA亞型的低致病性禽流感病毒，HA檢出率由高到低依次為H9、H6、H11、H12、H1、H3；與華東地區2002-2010年檢出的亞型相比存在較大的差異，華東地區有8種HA亞型，檢出率由高到低依次為H3、H6、H11、H1、H4、H9、H10、H8，主要流行的亞型有H3、H6、H11、H1、H4幾種，而H9、H10、H8較少檢出[7-9]。兩地亞型情況存在差異，一是廈門市H9亞型檢出率最高，在所有檢測的禽流感陽性禽群及環境樣品中均檢出H9亞型，而華東地區H9檢出率不高；二是廈門市未檢測出H4、H8和H10亞型；三是廈門市在3個禽群中檢測到H12亞型，而這種亞型在華東地區尚未見報道。廈門市與華東地區H6亞型的檢出率均高居第二，可見這種亞型廣泛分布在華東和福建地區，仍是目前主要流行毒株。筆者認為亞型檢出率差異大的原因主要有以下4點：一是研究的年份不同，不同亞型毒株有自身的流行規律，每隔幾年就會出現一次大流行；二是不同的地域、氣候、溫濕度條件，都會影響流感病毒的進化及流行情況，有些毒株較適應當地的環境，就形成了當地的流行毒株；三是不同地區家禽的種群結構不同，陸禽和水禽的品種、比例存在差異，飼養模式不同，防疫條件不同，免疫壓力不同，交易市場家禽來源不同等均會造成毒株之間的差異；四是不同地區候鳥的遷徙種類和數量亦存在差異，因此由候鳥傳播給家禽的毒株亦存在差異。

研究發現，鴨的感染情況復雜，多以3種以上亞型的混合感染為主，這增加了防疫的難度。水禽被認為是禽流感病毒的儲存庫和傳染源，可以通過公用水域與野鳥接觸，隱形感染多種亞型病毒而不發病，為各亞型的基因重組提供了良好的載體，加快表面蛋白的變異，不斷豐富內部基因的重配，最終又可以通過與陸禽的接觸將變異的新型病毒傳播給陸禽，引起新型病毒的流行與爆發。因此筆者認為水禽的防疫是禽流感防控的重點和難點，盡管水禽很少因感染禽流感病毒發生大規模的死亡，但因其在禽流感病毒傳播和進化中的重要地位，該病的防控絕不能忽視對水禽的監測，同時應盡量避免野生水禽、家養水禽及其它野鳥與陸禽間的相互接觸。

雞的感染主要以H9N2亞型病毒為主，檢出率位居首位，預示著未來防疫的艱巨性。一方面H9N2自身出現毒力增強的趨勢。H9N2作為弱毒僅造成家禽呼吸道癥狀，通過進化變異成可致死禽類的強毒株，給養殖業造成巨大損失。另一方面該亞型毒株已突破宿主種間屏障，可感染人發病。早在1998-1999年香港、廣州地區就發生4例人感染H9N2病例[10]，隨后江西、長沙、成都、云南、四川等地均出現H9N2感染人病例的報道[11-15]。人群H9N2血清學調查數據也驗證了H9N2可感染人的結論[16]。不僅如此，H9N2還為1997年香港暴發的感染人H5N1、2013年國內暴發的感染人H7N9及2014年感染人H10N8等亞型流感病毒提供內部基因[17-19]，說明潛在高致病的毒株可以與H9N2進行基因整合，并從H9N2的基因中獲得更適合其生存和致病的基因，產生毒力更強，宿主范圍更廣的新型毒株，達到其進化的目的。因此筆者認為，在今后的防疫工作中，在兼顧高致病禽流感防控的同時，應加大對H9N2亞型的監控，養殖場應根據實際情況制定H9N2的免疫計劃，而活禽市場應加強管理消毒，并細化禽類基本信息，以便溯源，防止該亞型的大流行和傳染人事件的發生。

利益沖突：無