一種改良的布魯氏菌病抗體微量凝集檢測方法的建立與評價

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布魯氏菌病(Brucellosis)由布魯菌(Brucella)侵入機體引起的一種以發熱為特征的人獸共患慢性傳染變態反應性疾病。該病在世界范圍內廣泛流行，每年新發病例超過50萬例[1]，在我國近20年持續高發，是對人類健康和畜牧業發展危害最嚴重的一種傳染病[2]。布魯氏菌病的診斷技術包括血清學檢測技術和病原學檢測技術。細菌學檢測雖是診斷布魯菌病的金標準，但存在培養周期長、檢出率低、實驗室生物安全等問題。血清學檢測布魯氏菌抗體技術使用廣泛、生物風險小、操作簡便，是現階段最常用的技術。目前我國實行的 WS269-2007《布魯氏菌病診斷標準》中適用的血清學檢測技術有虎紅平板凝集試驗(RBPT)、標準試管凝集試驗 (SAT)、補體結合試驗(CFT)等。但血清學檢測技術的敏感性和特異性，不同的研究方法有不同的結果[3-4]。SAT雖然是確診布病的標準檢測方法，但需要大量的試管凝集抗原和患者血清，尤其在流行病學調查中，對大量標本進行檢測時費時費力。微量凝集試驗是對試管凝集試驗的改良，具有微量、簡便、穩定性和特異性好的特點。本研究建立一種可顯色的布魯氏菌病抗體微量凝集檢測方法(Microagglutination Test, MAT)，可在96孔V型板上同時檢測24份標本，且結果易判讀，更適宜基層防疫人員現場檢測，最終為疫情處置提供強有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1確診病例定義 根據我國《布魯氏菌病診斷標準》(WS269-2007)：流行病學接觸史、臨床癥狀和 RBPT法陽性以及 SAT滴度為1∶100(++)及以上，滿足以上3項條件者確診為布病病人。

1.2主要試劑 布魯氏菌病RBPT抗原和SAT抗原由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.3顯色微量凝集抗原制備 取常規試管法抗原用虎紅染料染色，然后用生理鹽水分別稀釋成1∶5、1∶10、1∶20備用。

1.4標準陽性血清效價測定 采用SAT按我國《布魯氏菌病診斷標準》(WS269-2007)方法操作，用標準陰性血清對照進行標準陽性血清標定，其結果應為1∶400。

1.5顯色微量凝集抗原最佳濃度的優化 用33份布病病人陽性血清、1份標準陽性血清和1份陰性

血清按照常規SAT法，每份血清樣品分別加入1∶5、1∶10和1∶20抗原，混勻，加蓋，放入濕盒，置37 ℃溫箱，20 h取出，室溫靜置1 h觀察結果。

1.6結果判讀標準 常規SAT參照國標WS269-2007方法，以凝集程度為“++”為最終效價；微量SAT以V型管底不出現非常明顯紅點或極小紅點為陽性。

1.7統計方法 試驗結果使用Excel進行錄入, 對全部結果應用SPSS 20.0統計軟件進行分析。兩種方法比較差異應用卡方檢驗，P>0.05表示兩種方法差異無統計學意義。

2 結 果

2.1微量凝集試驗 顯色結果第1～8孔血清濃度分別為1∶50，1∶100，1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200和……1∶6 400，MAT以V型管底不出現非常明顯紅點或極小紅點為陽性，部分結果見下圖1。20和64為陰性結果；29、4、12、88、89和66為陽性結果(圖中用“+”表示)，效價分別為1∶800、1∶400、1∶400、1∶200、1∶800和1∶100。

圖1 微量凝集試驗顯色結果Fig.1 Results of MAT(the part of samples)“+”means antibody positive titers

2.2抗原優化結果 用33份陽性血清和3份陰性血清進行測試，當微量凝集抗原濃度為1∶10時，與SAT結果最吻合，見表1。

表1 MAT試驗抗原優化結果Tab.1 Optimization of MAT antigen

2.3SAT和MAT結果一致性比較結果 對142個血清樣本同時做SAT和MAT，結果SAT檢測得到21份陰性樣本，22份可疑樣本(1∶50)，99份陽性樣本(>1∶100)。MAT檢測得到30份陰性樣本、17份可疑樣本(1∶50)、95份陽性樣本(>1∶100)。如圖2所示，圖中數字對應橫縱坐標即為試驗結果(例如MAT結果與SAT結果均為1∶200陽性的樣品個數為12)這兩種試驗方法結果相同的占70.4%(100/142)，位于對角線方格內，結果相差1個滴度的占28.6%(40/142)，相差2個滴度的占1.4%(1/142)。兩種試驗方法相關系數為0.978。

注：此圖類似于橫縱坐標圖，圖中數據為樣本數，對應的橫縱坐標分別為該樣本數對應的SAT結果與MAT結果，空格即代表樣本數為0

2.4MAT評價指標分析結果 以SAT為參照標準，MAT敏感度和特異度分別為分別為98.9%和92.3%；和常規試管凝集法相比，兩種方法符合率為96.5%。見表2。

表2 微量凝集試驗效果評價Tab.2 Evaluation indicators of MAT

2.5MAT和SAT兩種試驗方法統計學檢驗結果 用配對χ2檢驗，χ2=0.8，P>0.05，兩種方法不存在統計學差異，見表3。

表3 MAT與SAT兩種方法檢測血清陽性結果Tab.3 Statistical testing between MAT and SAT

3 討 論

動物布魯氏菌病診斷技術GB/T 18646-2018中，增加了試管凝集試驗中的微量法，目的就是為現場檢測人員提供一種操作簡易，判讀方便，成本低、通量高的一種免疫學檢測方法。目前，人布魯氏菌病診斷標準(WS269-2007)中還沒有微量凝集法，也沒有商品化的微量凝集抗原，本研究不僅可為臨床及公共衛生部門診斷布病提供一種新方法，也可為今后修改人布魯氏菌病診斷標準提供數據。

本研究優化了微量凝集試驗抗原濃度，最終確定為1∶10為最適濃度，與國內外文獻報道相符[5-8]。SAT和MAT兩種方法經統計學檢驗差異無統計學意義，不符合的檢驗結果可能與操作誤差及肉眼判讀有關，還需大樣本量的驗證。此外，筆者還驗證了不同血清量對結果的影響，10 μL血清可以保證結果準確可靠，節省了樣本量。ELISA也可以對大樣本量檢測[6, 9-11]，筆者實驗室目前也在對ELISA、SAT和MAT進行評價。

試驗結果真實性的評價指標為靈敏度和特異度，靈敏度越高反映該試驗發現病人的能力越強；特異度越高反映該試驗確定非病人的能力越強。可靠性評價指標是符合率和Kappa值，這兩個指標可以反映試驗判定的結果與標準診斷結果的一致性[12]。ROC曲線是評價檢驗試驗的一種全面、準確、有效的方法，曲線下面積反映了診斷試驗價值的大小，面積越大，越接近1.0，診斷的真實度越高。由表2可以看出，本實驗具有較高的靈敏度特異度符合率(接近100%)，Kappa值與ROC曲線下面積接近1，真實性可靠性較好。目前部分國外學者對該方法的研究結果與本實驗室的研究結果相同，說明MAT可以替代現有的SAT。與SAT相比，MAT的優點在于：1)省時省力：在進行大量標本檢測時，國家規定的試管凝集法顯得費時費力，操作時需要反復刷洗試管和吸管，占用大量的試管架和溫箱空間，且判定結果時需要一一對比，操作起來很不方便；2)準確性高：微量凝集試驗使用精密的微量移液器，避免了使用吸管所產生的誤差，使用一次性96孔V型板和吸頭，避免了由于試管和吸管洗刷不干凈產生的影響；3)成本低，結果易于判讀：由于使用的抗原(50 μL)和待檢血清(10 μL)都是微量，節省了標本和試劑，由于采用顯色的抗原，結果判讀一目了然；4)易于推廣：微量凝集法檢測所需的待檢血清樣品的量是試管法的1/10，因此采血量明顯減少，工作量也會減少；一次可以同時檢測24份標本，十分有利于獸醫和人醫在生產實踐中的推廣。

綜上所述，本研究建立了較為準確、可靠的布魯氏菌病微量凝集檢測方法，發展了布病的快速檢測技術，但因樣本量較少，仍需后續研究重復驗證，以期盡快應用于布病現場的快速檢測。

利益沖突：無