姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌p38 MAPK的表達(dá)及抗氧化能力的影響

楊 棟，莫中成

過度訓(xùn)練是一種大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員骨骼肌組織中活性氧（reactive oxy gen species，ROS）的生成增加，細(xì)胞抗氧化和氧化平衡被破壞，骨骼肌發(fā)生過勞性損傷（常波 等，2014；肖衛(wèi)華 等，2014）。因此，運(yùn)動(dòng)過程中，如果機(jī)體的抗氧化能力得到改善，可有效預(yù)防訓(xùn)練時(shí)骨骼肌損傷。

姜黃素（curcumin）是姜黃根中重要的活性成分之一，屬二酮類化合物，在抗炎、抗衰老、抗腫瘤、利膽、抗氧化等方面具有非常廣譜的生物學(xué)作用（鄭佳 等，2013；周瑤瑤 等，2016；Jin et al.，2015；Nagahama et al.，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以清除體內(nèi)的氧自由基，是一種高效抗氧化劑（池愛平 等，2006）。但在運(yùn)動(dòng)損傷中，姜黃素是否可以影響骨骼肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)仍不清楚。本研究以負(fù)荷游泳訓(xùn)練創(chuàng)建過度訓(xùn)練大鼠模型，觀察姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌抗氧化能力的影響，并探討其初步分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取7周齡Wistar雄性大鼠40只，平均體重為223.35±16.23 g，均由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。所有大鼠均飼以基礎(chǔ)飼料和蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。適應(yīng)飼養(yǎng)3天以后，隨機(jī)分為4組：空白對照組（control group，CG）、有氧訓(xùn)練組（aerobic training group，ATG）、過度訓(xùn)練組（overtraining group，OG）、過度訓(xùn)練+姜黃素干預(yù)組（overtraining and curcumin-treated group，OCG），每組10只。訓(xùn)練時(shí)，每組大鼠自由攝食和飲水，OCG組每天以100 mg/kg姜黃素灌胃1次，其他組予以相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃作為對照。

1.2 試劑來源與訓(xùn)練方案

姜黃素為Sigma公司分裝，TRIzol試劑、PVDF膜購自Invitrogen公司，擴(kuò)增用引物由上海生工公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自長沙佳和生物科技有限責(zé)任公司，p38 MAPK一抗及HRP標(biāo)記的IgG二抗購自Abcam公司，SOD活性、MDA含量、 CK活性和 LDH活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

訓(xùn)練方案參考文獻(xiàn)進(jìn)行（崔笑梅 等，2017），具體方案如下：CG組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，ATG組每天進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練60 min。OG組和OCG組每天進(jìn)行遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)，即第1～3周，不負(fù)重，只遞增運(yùn)動(dòng)時(shí)間以增加運(yùn)動(dòng)負(fù)荷（第1周5～30 min，第2周30～60 min，第3周60～120 min）；第4～6周固定運(yùn)動(dòng)時(shí)間并增加運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量（第4周負(fù)荷1%～2%體重，第5周負(fù)荷2%～4%體重，第6周負(fù)荷4%～6%體重）。游泳用玻璃槽水深50 cm，溫度為31.0±2.0℃，箱底放置有水泵，防止大鼠靜止在水面。訓(xùn)練期間，每周訓(xùn)練6天，休息1天，全程共6周。

1.3 取材與檢測

大鼠于末次訓(xùn)練結(jié)束后，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈處取全血置抗凝管，取血清檢測血清睪酮，以評價(jià)大鼠過度訓(xùn)練模型的建立情況。同時(shí)分離大鼠兩側(cè)的深層腓腸肌，冰PBS漂洗后置于超低溫保存?zhèn)溆谩２捎梅止夤舛确y定骨骼肌SOD活性及MDA含量，乙酰半胱氨酸法檢測血清中CK活性，苯肼顯色法檢測血清中LDH 活性，所有指標(biāo)檢測均嚴(yán)格按試劑盒的操作說明執(zhí)行。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 檢測mRNA的含量

采用TRIZOL法常規(guī)提取組織總RNA，經(jīng)紫外線分光光度儀測定其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，按試劑盒說明先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以其cDNA產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。定量PCR反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行，采用25 μl的反應(yīng)體系，其中含有SYBR green mix（2x） 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，cDNA 2μl，上下游引物各1 μl。擴(kuò)增程序：95℃ 10 min，擴(kuò)增循環(huán)95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃采集熒光信號，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 Western blot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)

采用RIPA裂解液常規(guī)裂解骨骼肌組織，以BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測，蛋白變性后以每孔20 μl的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳（分離膠濃度為10%），再經(jīng)半干電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗置于4℃冰箱搖床孵育過夜，取出后以0.1% Tween-PBS漂洗3次（每次5 min），再室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h，經(jīng)0.1%Tween-PBS洗3次（每次5 min），最后以蛋白質(zhì)印跡發(fā)光檢測試劑盒顯示于Tanon化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，計(jì)算分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，兩組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 訓(xùn)練結(jié)束后大鼠血清睪酮的變化

為期6周的訓(xùn)練結(jié)束后，CG組、ATG組大鼠狀態(tài)正常，而OG組大鼠則表現(xiàn)出神態(tài)倦怠，易受驚嚇等癥狀。血睪酮水平是反映疲勞的消除和體現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力變化的重要指標(biāo)，結(jié)果顯示，OG組的血清睪酮水平顯著下降（P＜0.05），提示大鼠過度訓(xùn)練模型建立成功。而OCG組大鼠血清睪酮的水平有所上升（P＜0.05），提示姜黃素可以在一定程度上緩解過度訓(xùn)練導(dǎo)致的大鼠血清睪酮水平的下降（圖1）。

圖1 各組大鼠血清睪酮水平的變化Figure 1. Changes of Serum Testosterone Levels in Each Group

2.2 姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量，以及血清中CK和LDH活性的影響

訓(xùn)練結(jié)束后，采用試劑盒分別檢測各組大鼠骨骼肌組織中SOD活性和MDA含量（表1），與CG組比較，ATG組大鼠的SOD、CK和LDH活性無顯著變化（P＞0.05），而OG組SOD活性顯著下降，CK和LDH活性則顯著上升（P＜0.05），但是增加姜黃素干預(yù)的OCG組大鼠SOD的活性明顯高于單純的OG組，而CK和LDH活性則低于單純的OG組（P＜0.05）。骨骼肌MDA的含量，ATG組與CG組無顯著差別（P＞0.05），但是OG組較CG組明顯升高（P＜0.05）；而與單純OG組比較，OCG組大鼠MDA的含量測顯著降低（P＜0.05）。

2.3 姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA和蛋白表達(dá)的影響

訓(xùn)練結(jié)束后，采用熒光定量PCR試劑盒檢測各組大鼠骨骼肌組織中p38 MAPK mRNA的表達(dá)含量（圖2），與CG組和ATG組比較，OG組大鼠的p38 MAPK mRNA的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；而與OG組比較，增加了姜黃素干預(yù)的大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA的表達(dá)則下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌P38 MAPK mRNA表達(dá)的影響Figure 2. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK mRNA in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

采用Western blotting檢測各組大鼠骨骼肌組織中p38 MAPK 蛋白的表達(dá)（圖3），與CG組和ATG比較，OG組大鼠p38 MAPK 蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；而與OG組比較，增加了姜黃素干預(yù)的大鼠骨骼肌p38 MAPK蛋白質(zhì)的表達(dá)則下調(diào)（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量以及血清中CK和LDH活性的變化Table 1 Changes of SOD Activity，MDA Content，CK Acitvity and LDH Activity in Skeletal Muscle of Rats （n=5）

3 討論

隨著競技體育競爭越發(fā)激烈，運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練強(qiáng)度逐漸加大，更容易出現(xiàn)過度訓(xùn)練導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員骨骼肌受損。因此，預(yù)防過度訓(xùn)練所造成的損傷以及探討過度訓(xùn)練導(dǎo)致骨骼肌損傷的機(jī)制成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的重要研究領(lǐng)域（Gandra et al.，2012；Pereira et al.，2013）。本研究應(yīng)用游泳訓(xùn)練的方式建立過度訓(xùn)練大鼠模型，檢測了反映過度訓(xùn)練狀況的常用指標(biāo)血清睪酮的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OG組大鼠的血清睪酮水平顯著下降，說明大鼠出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)性疲勞低血睪酮水平，結(jié)合大鼠機(jī)體狀況的表現(xiàn)，證實(shí)過度訓(xùn)練大鼠模型建立成功。

過度訓(xùn)練導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一的認(rèn)識。機(jī)體在過度訓(xùn)練時(shí)，組織的耗氧量會增加，產(chǎn)生的氧自由基也會增加，這樣會使機(jī)體內(nèi)抗氧化劑及合成抗氧化酶的成分過度消耗，如果不能及時(shí)補(bǔ)充，就會引起機(jī)體抗氧化能力的下降，從而使氧自由基的清除能力減弱，進(jìn)而損傷骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞器，從而影響運(yùn)動(dòng)能力（Merry et al.，2016；Shill et al.，2016）。因此，機(jī)體抗氧化能力的保護(hù)，是增加肌肉承受更大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度能力的一個(gè)關(guān)鍵因子。本研究中，過度訓(xùn)練的大鼠SOD活性顯著降低，MDA含量增高，表明過度訓(xùn)練可以降低大鼠骨骼肌的抗氧化能力，血清中CK和LDH 活性明顯增高，提示骨骼肌組織存在損傷。

圖3 姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌p38 MAPK 蛋白表達(dá)的影響Figure 3. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK Protein in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

姜黃素提自于姜黃根，屬于姜科，是咖喱食品中的主要成分，被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)的中醫(yī)治療。姜黃素是姜黃根中具有治療活性的主要物質(zhì)之一，在骨骼肌損傷的保護(hù)過程中也有重要作用。吳珊等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過抑制炎性因子分泌及泛素-蛋白酶體關(guān)鍵分子表達(dá)，緩解免疫應(yīng)激大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)降解。姜黃素可通過抑制NF-κB 表達(dá)，從而促進(jìn)C2C12 骨骼肌細(xì)胞的增殖分化（魏連波 等，2015）。高超等（2017）認(rèn)為，姜黃素對小鼠急性游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的骨骼肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制主要是通過其抗氧化作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，可通過抑制氧化酶、激活和保護(hù)抗氧化酶系等方式，清除氧自由基，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，減輕細(xì)胞損傷。本研究中，在建立過度訓(xùn)練大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用了姜黃素干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以提高過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌SOD的活性，降低MDA含量及血清中CK和LDH 的活性，提示姜黃素在一定程度上可以提高過度訓(xùn)練損傷后骨骼肌的抗氧化能力，并對骨骼肌的疲勞性損傷產(chǎn)生緩解作用。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白激酶之一，其介導(dǎo)的信號通路可以將胞外刺激信息傳導(dǎo)至胞核內(nèi)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而參與細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。p38 MAPK是MAPK家族的重要一員，有研究發(fā)現(xiàn)，過度的氧自由基聚積可以激活p38 MAPK，從而活化MAPK系統(tǒng)，進(jìn)而影響骨骼肌細(xì)胞的功能（李琳燕，2011；Martinez et al.，2016）。本研究檢測了p38 MAPK的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OG組大鼠骨骼肌組織p38 MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，而應(yīng)用姜黃素干預(yù)后，在一定程度上可以使大鼠骨骼肌組織p38 MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，提示p38 MAPK在過度訓(xùn)練所致的大鼠骨骼肌損傷中有一定的作用，而且參與了姜黃素對骨骼肌疲勞性損傷的緩解作用。

4 結(jié)論

過度訓(xùn)練可以導(dǎo)致骨骼肌組織抗氧化能力下降，造成骨骼肌疲勞性損傷，而應(yīng)用姜黃素干預(yù)后，可以有效緩解過度訓(xùn)練所導(dǎo)致的機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，并下調(diào)p38 MAPK的表達(dá)，提高抗氧化能力，從而緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與發(fā)展。