低氧調控EIMD后calpain活性與肌細胞膜損傷機制的探索研究

徐 飛，覃麗鳳，黃巧婷，曹建民，王 平，徐玉明*

前言

高原低氧會降低肌肉工作能力、改變肌纖維（肌細胞）的形態和代謝功能，最終導致骨骼肌萎縮（Martin et al.，2017）。而大強度離心運動造成肌纖維微損傷和延遲性肌肉酸痛是運動性肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）的主要癥狀。但因低氧影響肌肉代謝和肌纖維損傷（Luo et al.，2016；Rovida et al.，2015）的機制不明確，所以低氧下提高肌肉工作能力的營養補劑和訓練方法的應用受限。有研究發現，離心運動導致的肌損傷與鈣激活中性蛋白酶—泛素（calpain-ubiguitin）結合途徑有關（金其貫 等，2010，2011）。calpain是一種蛋白降解酶，其被激活后會降解肌肉的各種蛋白，所以calpain在離心運動導致肌纖維損傷過程中的作用備受關注。Lomonosova等（2014）觀察到，當肌纖維損傷程度降低時calpain活性也降低，提示calpain與肌損傷有關。已證實大強度離心運動和低氧導致細胞鈣超載是激活calpain的關鍵。隨著研究推進，證實肌細胞內微摩爾（μ mol）和毫摩爾（m mol）級的Ca2+濃度便可激活calpain家族的calpain1（μ-calpain）、calpain2（m-calpain）（Bartoli et al.，2005）。骨骼肌和心肌特異性高表達的calpain3，也成為關注焦點（Murphy et al.，2006，2009，2011）。

細胞膜被破壞是細胞不可逆性損傷的關鍵環節，膜骨架蛋白丟失是膜損傷的重要機制（王金發，2003）。抗肌萎縮蛋白dystrophin（Freitas et al.，2016）、utrophin（Guiraud et al.，2017）是肌細胞主要的肌節外骨架蛋白，dysferlin高表達于骨骼肌，并參與肌細胞膜融合修復（Bansal et al.，2003；Cardenas et al.，2016），3種骨架蛋白對維持肌細胞和肌細胞膜的形態和功能具有重要作用。已證實，肢帶型肌營養不良癥（limb-girdle muscular dystrophy，LGMD）主要與肌膜蛋白和近膜蛋白缺陷有關，其中dystrophin是關鍵蛋白（Guiraud et al.，2017），也發現LGMD-2A和2B型的缺陷蛋白分別為calpain3和dysferlin（Roudaut et al.，2013）。上述證據鏈提示：低氧和離心運動導致的Ca2+超載－激活calpain－calpain激活后降解細胞膜骨架蛋白－膜骨架蛋白丟失－影響細胞膜形態和功能。因此，探索calpain在低氧對EIMD后肌細胞膜損傷中的作用和調控機制，對醫學和運動科學領域的研究有重要參考價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與實驗設計

110只SPF級8周 齡 雄 性SD健 康 大 鼠（體 重196.6±10.1 g，購自北京維通利華公司）在22±2℃、30%～60%相對濕度環境下，以標準嚙齒類動物飼料分籠飼養，12/12 h光照/熄燈晝夜交替，自由飲食。適應環境3天后分批完成低氧觀察實驗（研究I，圖1B）和抑制劑實驗（研究II，圖1C）①各組如有大鼠脫落，用備用大鼠補齊樣本。。研究I（低氧對EIMD后膜損傷、calpain和膜骨架蛋白的影響）：70只大鼠隨機分為7組（每組n＝10），包括安靜對照組（C組）、常氧24 h、48 h和72 h組（N24、N48和N72組）以及低氧24 h、48 h和72h組（H24、H48和H72組）。研究II（抑制劑實驗，驗證calpain對肌細胞膜損傷的影響）：40只大鼠隨機分為5組（每組n＝8），包括空白對照組（blank，B）、安慰劑（placebo，Pl）24 h和48 h組（Pl-24和Pl-48h組）和calpain抑制劑（inhibitor，I）24 h和48 h組（I-24和I-48h組）②24 h組伊文氏藍注射時間點為運動后即刻，48 h組伊文氏藍在運動后即刻和運動后24 h共注射2次。。

低氧EIMD動物模型：除C組和B組外，各組大鼠均進行4天常氧適應跑臺訓練，恢復后依據大鼠骨骼肌損傷模型（徐飛 等，2017；Armstrong et al.，1983）在低氧（氧濃度12.7%）下進行間歇性大強度下坡跑（離心）運動。運動方案：速度26.8 m/min，坡度-16°，每組持續5 min，共10組，組 間間歇1 min。

圖1 實驗設計示意圖Figure 1. The Schematic Diagram of Experimental Design

1.2 取材及測試

1.2.1 腹腔注射伊文氏藍染色

腹腔注射伊文氏藍（evans blue dye，EBD）熒光染色劑（Sigma，USA），觀察膜通透性變化以鑒別損傷模型。常氧與低氧24 h、48 h和72 h組腹注時間分別為運動后即刻、運動后24 h和運動后48 h（圖1A）。EBD注射前經Millex-GP 0.22 μm過濾器（Millipore，USA）滅菌，注射劑量為1 mg EBD/0.1 ml PBS（pH7.4）/10 g體重。

1.2.2 取材與處理

各組大鼠完成實驗后，以2.3 ml/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，然后迅速分離腓腸肌，取淺層中間段肌纖維，切塊凍存。于冰上切取3×3×5 mm3，OCT包埋后用液氮預冷的正己烷（-70℃）速凍，錫紙包裹后投入液氮，以制備冷凍切片。

1.2.3 鑒別肌細胞膜完整性

將EBD染色組織塊用Leica冰凍切片機（CM 1850，Germany）切成6 μm厚度樣本，熒光顯微鏡568 nm檢測。激光共聚焦顯微鏡（Leica sp8，Germany）觀察EBD切片，測量左、右、中部、上、下5個視野，IPP 6.0光密度分析軟件統計EBD陽性細胞率（positive ratio of cells，PRC），鑒別肌細胞膜完整性。

1.2.4 注射calpain抑制劑

用0.1 M PBS配好的10% DMSO溶解calpain抑制劑MG-132（Selleck，USA），現配現用。大鼠運動后即刻腹腔注射MG-132（劑量15 mg/kg體重），然后置于低氧恢復，I-48、Pl-48組在24 h后再次注射。安慰劑組腹腔注射等量生理鹽水。各組取材要求及測試方法相同。

1.2.5 反轉錄實時定量PCR（RT-qPCR）

用反轉錄實時熒光定量PCR檢測calpain和膜骨架蛋白的mRNA表達，PCR擴增引物（Invitrogen，USA）序列（5’to 3’）：calpain1上下游引物（105 bp）分別為AGACCATTGGTTTTGCAGTGTA、CTGATTGTGCCCGAGAAGC，calpain2上下游引物（205 bp）分別為GGCTTCGGCATCTATGAGGT、GAAATCGCCATTCTTGTGGG，calpain3上下游引物（100 bp）分別為TTTCAGACAGAGCAAACAGCAACAA、TGTGGGCTTTCCCCTTGTTTAT，dystrophin上下游引物（154 bp）分別為GTGTCCTCTCCTTCTACCTCGCT、 GCTCCATCACTTCTTCTAACCCTGT，utrophin上下游引物（144 bp）分別為CAAAAGCAAGTAGGAAAGGCGTTAG、ATCCTGCAGCGAGTCGATAAGC，dysferlin上下游引物（98 bp）分別為ATCATCCGAGCATTTGGCTTACA、TCCTGGTCACTCACTGATTTCTTCC，內參GAPDH上下游引物（138 bp）分別為TGGAGTCTACTGGCGTCTT、TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。用超純RNA試劑盒（CWbio，Cat#CW0581）提取組織樣本總RNA，取5 μl RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用DNaseⅠ試劑盒（CWbio，Cat#CW2090）對RNA中殘留基因組DNA進行消化處理，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio，Cat#CW0744）進行反轉錄，ABI-7500型熒光定量PCR儀，2-△△CT法進行相對定量分析，嚴格按說明書操作。

1.2.6 Western blot（WB）測定calpain及膜骨架蛋白的含量

取凍存的腓腸肌樣本剪碎，加入1 ml含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，在抽提蛋白前加入0.1 M PMSF母液（終濃度為1 mM）。根據選取測試樣本重量按溶液：裂解液體積（1：9）加入裂解液，以15 000 rpm進行3次勻漿（每次10 s，間隔10 s）。勻漿時用冰水混合物浸泡進行降溫，勻漿完成后于冰上孵育20 min，13 000 rpm 4℃離心20 min，然后取上清液分裝保存，待測。BCA法測定肌組織蛋白濃度，BCA工作液A液：B液＝50：1，稀釋各BSA標準品，樣品用PBS進行稀釋。樣品：BCA工作液＝1：8，混勻后進行60 min室溫孵育，用酶標儀（570 nm波長）讀取對應OD值。

蛋白濃度調整：參照標準曲線，根據吸光度求總蛋白量濃度，用RIPA調整蛋白濃度，加入5倍還原樣品緩沖液，樣品終濃度為4 mg/ml，煮沸變性5 min。據目的蛋白分子量，配制8%和12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%，樣品上樣量為20 μg/孔。電泳條件：濃縮膠恒壓90 V、約20 min，分離膠恒壓160 V，通過預染蛋白marker確定電泳時間。用濕轉法進行轉膜。轉膜完成后用麗春紅染色劑對膜染色并觀察轉膜效果。然后將膜浸沒在3%的BSA-TBST中，于室溫下輕搖30 min。再于室溫下孵育10 min，稀釋一抗后4 ℃過夜（一抗稀釋比例：calpain1α為1：2 000，calpain1β為1：4 000，calpain2為1：4 000，calpain3為1：1 000，dystrophin為1：2 000，utrophin為1：200，dysferlin為1：2 000）。次日4 ℃拿出膜后室溫孵育30 min，TBST洗膜5次（每次3 min）。二抗用5%脫脂奶粉-TBST稀釋，二抗：山羊抗兔IgG為1：20 000，山羊抗小鼠IgG為1：10 000，室溫輕搖40 min。TBST洗膜6次（每次3 min）。ECL加到膜上反應3～5 min，發光顯影、膠片曝光、定影得到目的條帶圖像。采用ImageQuant TL軟件計算IOD值。β-tubulin（鼠單抗，1：2 000）作為內參。

1.3 數據處理

數據以均數±標準差（M±SD）表示。將對照組的值處理為1作為基線值，calpain和細胞膜骨架蛋白相關指標進行標準化（與基線值的倍數關系）。雙因素方差分析（two-way ANOVA）考察低氧與暴露時間的主效應和交互作用。交互作用不顯著時，只考察低氧主效應對因變量的影響，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）；交互作用顯著時，用簡單效應分析估計邊際均數。多重比較（post-hoc）用LSD法，顯著性差異臨界值置為P＝0.05。

2 研究結果

2.1 動物模型及膜損傷程度鑒定

EBD染色結果顯示（圖2），除C組外，EIMD后低氧和常氧各組肌細胞都有EBD侵入，切片結果顯示，H24和N48組更為明顯。PRC結果顯示，低氧各組與常氧對應組之間有極顯著差異（P＜0.01）。且低氧與常氧組PRC呈現出不同的峰值特征和恢復趨勢：低氧組PRC峰值出現時間（24 h）早于常氧組峰值出現時間（48 h）。72 h時，常氧組PRC已顯著降低（N72 vs. N48組內比較），低氧組PRC與H48組持平（膜損傷仍未恢復、且顯著高于常氧對應組（H72 vs. N72，P＜0.01）。

圖2 低氧對EIMD后大鼠腓腸肌EBD熒光染色及陽性細胞率的影響Figure 2. The Effect of Hypoxia on EBD of Gastrocnemius and Positive Ratio of Cells

2.2 低氧對EIMD后calpain和膜骨架蛋白mRNA表達的影響

2.2.1 低氧對EIMD后calpain mRNA表達的影響

低氧各組calpain1 mRNA表達與C組無顯著差異（P＞0.05），H72組顯著高于N72組（分別為1.067±0.360和0.783±0.178，P＜0.05，圖3A）。低氧各組calpain2 mRNA顯著高于C組，H72組顯著高于N72組（分別為1.736±0.970和1.437±0.671，P＜0.05，圖3B）。calpain3的mRNA表達無組間差異，但與calpain1和calpain2不同的是，低氧與常氧各組calpain3 mRNA隨時間延長而降低（圖3C）。

圖3 低氧對EIMD后calpain mRNA表達的影響Figure 3. The Effect of Hypoxia on mRNA Expression of Calpain after EIMD

2.2.2 低氧對EIMD后細胞膜骨架蛋白mRNA表達的影響

EIMD后低氧與常氧各組dystrophin和utrophin的mRNA表達顯著低于C組。dystrophin和utrophin的mRNA表達隨時間延長而降低，H24組顯著低于N24組（P＜0.01，圖4A、B）。utrophin的mRNA在72 h時出現上調，但組間無顯著差異（圖4B）。dysferlin的mRNA表達相對滯后，呈現先升高（48 h）后降低（72 h）的特征，組間無顯著差異（P＞0.05，圖4C）。

圖4 低氧對EIMD后膜骨架蛋白mRNA表達的影響Figure 4. The Effect of Hypoxia on mRNA Expression of Membrane Cytoskeleton after EIMD

2.3 低氧對EIMD后calpain和膜骨架蛋白表達的影響

2.3.1 低氧對EIMD后calpain蛋白表達的影響

WB結果見圖5。雙因素方差分析結果顯示，低氧×時間對calpain蛋白量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。考察低氧主效應發現，低氧各組calpain1、calpain2和calpain3與常氧各組比較都無顯著差異（表1）。

2.3.2 低氧對EIMD后細胞膜骨架蛋白表達的影響

低氧×時間對膜骨架蛋白（dystrophin、utrophin、dysferlin）蛋白含量的交互作用不顯著（P＞0.05），但utrophin1（F＝2.769，P＝0.076）和utrophin2（F＝2.498，P＝0.097）接近顯著性差異臨界值（表2）。考察低氧主效應發現，低氧各組dystrophin-R、dystrophin-C和dysferlin蛋白量與常氧各組無顯著差異（P＞0.05），H72組utrophin1高于N72組（P＝0.030），兩組的utrophin2接近顯著差異臨界值（P＝0.056）。

2.4 抑制劑實驗結果

2.4.1 抑制劑對calpain1和calpain2蛋白表達的影響

抑制劑組（I-24、I-48組）calpain1α、calpain1β和calpain2的蛋白含量顯著低于B組（P＜0.05），安慰劑組（Pl-24、Pl-48組）與B組無顯著差異（P＞0.05）。I-24組calpain1α和calpain2顯著低于Pl-24組（圖6B、D），I-48組calpain1α、 calpain1β和calpain2與P1-48組相比，無顯著差異（P＞0.05）。

表1 低氧對EIMD后calpain蛋白表達的影響Table 1 The Effect of Hypoxia on Calpain Protein Expression after EIMD

表2 低氧對EIMD后肌細胞膜骨架蛋白表達的影響Table 2 The Effects of Hypoxia on Protein Expression of Membrane Cytoskeleton after EIMD

2.4.2 抑制calpain1和calpain2對肌細胞膜損傷的影響

激光共聚焦顯微鏡切片觀察結果顯示，B組肌細胞無明顯EBD染料侵入（圖7A、B）。calpain抑制劑組和安慰劑組肌細胞均有EBD侵入，Pl-24和Pl-48組更為明顯（圖7D、F）。PRC結果顯示，抑制劑24 h、48 h組PRC顯著低于安慰劑對應組（分別為P＜0.01、P＜0.05），但仍顯著高于B組（分別為P＜0.05、P＜0.01，圖8）。安慰劑組（與研究I的低氧組為等效實驗處理）PRC峰值（19.40±2.51）出現在24 h，與研究I中低氧組PRC的峰值（21.00±7.69）接近，出現時間（24 h）相同（圖2F）。

3 討論

3.1 低氧對EIMD后肌細胞膜損傷的影響

離心運動導致EIMD的骨骼肌微損傷癥狀（Lieber et al.，1996；Nosaka et al.，1995）出現肌原纖維排列混亂和肌絲卷曲、斷裂等（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014），影響肌細胞膜的完整性和通透性（肌酸激酶升高、膜與細胞骨架分離、膜磷脂數量減少和磷脂降解產物堆積）（Cully et al.，2017；Hasenoehrl et al.，2017）。但尚不明確低氧對EIMD后肌細胞膜損傷的影響。本研究中，低氧和常氧各組EIMD后出現明顯EBD陽性細胞，EBD與血清蛋白結合形成伊文氏藍—白蛋白復合物可被激光共聚焦顯微鏡檢出，若觀察到胞內EBD陽性細胞增加，則表明肌細胞膜完整性受損（Hamer et al.，2002；Lomonosova et al.，2014）。而低氧組PRC顯著高于常氧組和對照組也驗證了EBD切片結果。本研究還發現低氧組PRC峰值前移和恢復延遲的現象（H72組PRC與H48組持平，并顯著高于N72組）。綜上，低氧提前了EIMD后膜損傷的時間并加劇了損傷程度。

圖6 抑制劑對calpain1、calpain2蛋白表達的影響Figure 6. The Effect of Inhibitor on Calpain1 and Calpain2 Protein Expression

圖7 抑制calpain1和calpain2對膜損傷的影響Figure 7. The Effect of Calpain1 and Calpain2 Inhibitor on Muscle Sarcolemma Injury

3.2 低氧對EIMD后calpain的影響

calpain是一種蛋白降解酶，主要作用于細胞、骨架蛋白、蛋白激酶和激素受體。calpain1和calpain2和calpain3最為常見，普遍認為calpain對肌肉結構、功能變化具有重要影響（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014；Murphy et al.，2009，2011）。但EIMD后低氧對calpain的影響與膜損傷的關系尚不明確。新近研究發現，低氧對calpain有激活作用（Hirata et al.，2015；Kovacs et al.，2016；Wang et al.，2016）。本研究RT-qPCR結果表明，低氧組calpain1、calpain2 mRNA顯著上調，與EIMD激活calpain的結果基本一致（Lomonosova et al.，2014）。此外，常氧組calpain1、calpain2 mRNA隨時間延長而降低（N72 vs. N48），低氧組mRNA隨時間延長而增加（H72 vs. H48）。結合PRC結果可知，常氧組calpain mRNA表達與PRC變化趨勢一致（mRNA下調－常氧組膜損傷緩解），低氧48h和72h組則相反（mRNA上調－低氧組膜損傷加劇）。提示低氧導致calpain1、calpain2基因表達上調與膜損傷加劇有關。這與新近研究證據吻合：低氧激活calpain1、calpain2后加速視網膜神經細胞死亡（Hirata et al.，2015）、激活calpain2后抑制肺動脈高壓患者血管重塑（Kovacs et al.，2016）。

圖8 抑制calpain1和calpain2對陽性細胞率的影響Figure 8. The Effect of Calpain1 and Calpain2 Inhibitor on the Positive Ratio of Cells

因calpain3呈骨骼肌特異性高表達，Murphy等（2011）報道，EIMD后24 h會激活calpain3，所以推測低氧也可能激活calpain3。但有趣的是，盡管低氧各組calpain3的mRNA表達低于常氧各組，但并無顯著差異；更有意思的是，低氧與常氧各組的mRNA表達都隨時間延長而降低（H72 vs.H24），這與筆者的研究假設和calpain1、calpain2對低氧應答的趨勢相反。所以，現有證據表明EIMD后低氧并未激活calpain3①本研究N24組calpain3的mRNA表達顯著高于C組（圖3C），與Murphy等（2011）發現離心運動短期內激活calpain3的結果一致，說明大強度離心運動能夠激活calpain3，但這不是本研究要證明和關注的內容，故并未展開討論。。Murphy等（2011）發現離心運動短期內激活calpain3，但calpain3不能易位進入細胞核和胞質，實際上他們早期另一項研究（Murphy et al.，2009）明確指出安靜時胞內Ca2+濃度而非肌肉拉伸的離心運動才是激活內源性calpain3的關鍵。本研究通過在體實驗也發現，EIMD后的低氧暴露并未激活calpain3，提示calpain3可能不是低氧導致膜損傷的主要途徑，也可能是EIMD－低氧－calpain3這個過程中存在某種調節calpain3的重要機制。但因缺乏更多有力的研究證據，還需進一步證實。Spencer等（2002）指出，calpain3在正常小鼠肌肉中的高表達并無明顯的有害作用。就目前證據而言，究竟是calpain3在低氧導致膜損傷中不起重要作用，還是存在某種調控calpain3－膜損傷的機制，尚不得而知。這是多年來有關calpain3研究的一個謎團，也是將來的研究無法回避的一個難點。

與mRNA不同的是，EIMD后低氧各組calpain1、calpain2和calpain3的蛋白含量與常氧各組都無顯著差異，提示，低氧對EIMD后calpain蛋白含量并無顯著影響。分析認為，calpain蛋白含量與基因表達不一致并不矛盾，而蛋白含量無顯著變化，并不能否定低氧對calpain的激活效應。首先，mRNA的豐度不一定與其翻譯產物（蛋白表達量）成線性關系，因為基因表達調控層次很多，轉錄只是其中一個環節，轉錄后調控和翻譯后調控都會影響最終蛋白量；此外，mRNA降解、蛋白的降解和修飾折疊等因素都可能導致mRNA與蛋白表達水平不一致。其次，本研究mRNA增加表明EIMD和低氧雙重因素使calpain基因轉錄和蛋白合成趨勢的增加，而最終蛋白含量無顯著增加與calpain激活后的消耗有關。因為calpain是自溶性蛋白水解酶（最大特點是Ca2+激活和自溶式水解，通過被激活來降解其他蛋白），其在自溶水解和降解其他蛋白的同時自身也被消耗，所以calpain蛋白含量應包括其降解其他蛋白所被消耗的部分。Murphy等（2006）也發現力竭運動不能使μ-calpain（calpain1）和calpain3的蛋白含量顯著增加，但其研究并未同步測試calpain的mRNA表達。另有多項研究證實，運動后calpain1和calpain3的mRNA表達顯著增加（Feasson et al.，2002；Jones et al.，2004），calpain的這種特殊性也體現在本研究結果中。

3.3 低氧對EIMD后細胞膜骨架蛋白降解的影響

肌細胞膜骨架蛋白與細胞骨架連接并與膜蛋白結合，維持膜生理功能。dystrophin及其同源蛋白utrophin（二者NH2端和COOH端相同）是肌細胞主要的肌節外調節蛋白（Freitas et al.，2016；Guiraud et al.，2017）。而高表達于骨骼肌的跨膜蛋白dysferlin主要參與膜的運輸和融合修復（Bansal et al.，2003；Cardenas et al.，2016）。本研究發現，低氧組dystrophin和utrophin的mRNA表達顯著低于常氧組（H24 vs. N24），蛋白含量并無顯著變化。而dysferlin的mRNA和蛋白含量都無顯著變化。膜骨架蛋白與肌原纖維肌動蛋白（F-Actin）的多個結合區域（Bansal et al.，2003；Bartoli et al.，2005；Cardenas et al.，2016）是易被攻擊的部位，初步發現dystrophin蛋白結構②是一個巨大蛋白，由3685個氨基酸組成，分子量約為427 kD。的中央竿狀區（R-rod，該蛋白主體結構）易被大強度離心運動（機械牽拉）破壞，而dystrophin羧基端（COOH，dystrophin-C）的穩定性易受低氧的影響（Stelter et al.，2016）和calpain的攻擊（Freitas et al.，2016）。但本研究發現，低氧加劇膜損傷時dystrophin-R、dystrophin-C蛋白并未丟失，說明EIMD后低氧加劇膜損傷，calpain被激活時該蛋白桿狀區和C端結構相對完整，這與本研究的研究假設相反。意外發現的是，dystrophin的mRNA和蛋白含量降低時，utrophin的mRNA和蛋白含量出現調節性增加，這印證了Guiraud等（2017）提出utrophin是杜氏肌營養不良癥開發新藥和基因療法中新靶點的觀點。因為dystrophin與utrophin是同源蛋白且生理功能相似，但Guiraud等（2017）的新發現與膜損傷無直接聯系。

EIMD后低氧激活calpain、加劇膜損傷，但膜骨架蛋白并無顯著變化，說明EIMD后calpain在低氧加劇膜損傷過程中，并不是通過攻擊（降解）膜骨架蛋白dystrophin、utrophin和dysferlin的途徑，也即是說calpain導致膜損傷可能有其它機制，可能是降解其它關鍵的膜相關蛋白，也可能是calpain與上述3種膜骨架蛋白之間存在某種重要的調節和平衡機制（徐飛 等，2017）。但此推理成立的前提是calpain與膜損傷存在必然聯系，本研究和前人研究發現，膜損傷和/或肌纖維損傷（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）時calpain有相應變化，只能說明二者存在相關關系，而非因果關系。綜上，確認EIMD后低氧加劇膜損傷中calpain的角色是機制研究的關鍵點。

3.4 calpain抑制效果評價及對肌細胞膜損傷的影響

低氧會導致骨骼肌廢用性萎縮和適應性萎縮（D’Hulst et al.，2013），calpain自溶式激活降解蛋白的特性對骨骼肌適應有重要作用（Kanzaki et al.，2017）。研究證實,離心運動后24 h大鼠股四頭肌超微結構受損，calpain被激活（calpain1、calpain2蛋白含量顯著增加）（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）。但上述研究未能通過在體或/和離體實驗證實抑制或激活calpain對膜損傷的影響。本研究采用的calpain抑制劑（MG-132）通過結合calpain中心基團，使蛋白酶失活或活力下降（但并不使蛋白變性），已應用于心肌（Adams et al.，2015）和骨骼肌（Joung et al.，2014）細胞損傷和修復的機制研究。本研究發現，MG-132使calpain1α和calpain2的蛋白表達量顯著降低，calpain1β也低于安慰劑組，說明calpain活性得到有效抑制，calpain1α和calpain2的抑制效果優于calpain1β。從蛋白結構來看，被激活的calpain1（有蛋白降解功能）是由大亞基α（催化區，80 kD）和小亞基β（調節區，30 kD）組成，calpain1α是兩個相關基因的產物，calpain1β是單個基因的產物。Kanzaki等（2017）通過大鼠在體實驗證實，抑制calpain活性對離心運動導致的快肌纖維損傷有顯著保護作用，且保護機制與蘭尼定受體和肌質網Ca2+-ATP酶途徑無直接關系。綜合觀察實驗（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）、抑制實驗（Kanzaki et al.，2017）和本研究結果，提示，抑制calpain活性對肌細胞膜損傷有保護作用。

肌細胞膜EBD染色結果發現，對照組肌細胞無明顯EBD染料侵入，抑制劑組和安慰劑組都觀察到EBD侵入細胞。結合抑制劑組PRC顯著低于安慰劑組的結果，說明抑制calpain1、calpain2能減輕膜損傷程度（對維持膜的完整性和正常功能有促進作用），而calpain1α和calpain2的作用可能大于calpain1β。這也在一定程度上從另一個角度證實，Freitas等（2016）離體實驗發現激活calpain會加速肌營養不良蛋白（dystrophin）丟失而惡化膿毒性心肌病的結果（本研究的在體實驗發現EIMD后低氧激活calpain不是通過攻擊dystrophin蛋白引起膜損傷，Freitas等采用心肌細胞培養實驗，沒有EIMD和低氧刺激）。本結果也支持Kanzaki等（2017）的研究結果。但需指出的是，雖然抑制calpain活性能有效減輕膜損傷，但效果并不是十分理想，因為抑制劑各組PRC仍顯著高于對照組，所以除calpain1、calpain2機制外，可能還有其它機制調控EIMD后低氧對膜損傷的過程（徐飛 等，2017）。推測與miRNA調控mRNA－蛋白表達過程有關（一個miRNA可調控多個基因的表達，多個miRNA組合也可精細調控單個基因的表達），已發現骨骼肌特異性表達的miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）能精細調控calpain降解膜骨架蛋白的過程（Mancinelli et al.，2016）。Roudaut等（2013）也觀察到miRNA調控calpain3基因缺失導致LGMD大鼠骨骼肌dystrophin蛋白的表達。所以這可能是將來calpain激活與膜損傷機制研究的一個重要方向。

4 結論

1. calpain1、calpain2被激活與低氧加劇大鼠EIMD后肌細胞膜損傷有關，但calpain并非通過降解膜骨架蛋白dystrophin、utrophin和dysferlin而導致膜損傷。

2. 抑制calpain1、calpain2活性能有效減輕但不能避免低氧加劇EIMD后的膜損傷，其中還可能存在其它調節機制。