血小板濃縮物質在脂肪液化創面治療中的研究進展

（廣東醫科大學，廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江，524000）

隨著肥胖人群及糖尿病患者人數的增加，術后傷口脂肪液化在臨床治療中有明顯增多趨勢。據國內文獻報道[1]，腹部術后切口脂肪液化的發生率約為8.20%。脂肪液化目前已成為普外科、婦產科、骨科的常見術后并發癥。吳階平，裘法祖等在《黃家駟外科學》[2]中就指出：切口發生脂肪液化后如經久不愈則有利于細菌滋生導致感染，延長住院時間，加重患者心理及經濟負擔。在臨床診療中，傷口脂肪液化應當引起醫生的高度重視。然而我國對傷口脂肪液化的診治尚無臨床指南，目前常用治療方式有：清創負壓引流、光線治療、高滲糖胰島素治療、濕性輔料治療，血小板濃縮物質治療，中藥中醫治療等幾大類[3]。血小濃縮物質作為新型創面修復材料，因其制備方法簡便、成本低廉、具有較高的臨床實用性，所以本文將圍繞血小板濃縮物質及其在脂肪液化創面治療領域的進展進行綜述，以期待為脂肪液化創面的治療帶來新的思路。

1、血小板濃縮物質的發展

上世紀80年代，最初的血小板濃縮物質在濃縮提取后，可釋放6-8倍生理計量生長因子[4-5]。在臨床中用于促進外科手術的傷口及創面愈合。到上世紀90年代PRP的概念被提出，并由Whitman[9]和Marx[10]首先將其應用于臨床治療。隨著PRP制備技術的提高，血小板濃縮純度得到了大幅提升，PRP中血小板濃度可達到95%以上。近年來PRP已廣泛應用于頜面外科、神經外科、骨科、整形美容外科等領域。但PRP的應用有其局限性，PRP制備耗時長，在第二次離心轉移試劑時可能出現污染，制備時使用的抗凝劑、氯化鈣、血凝酶等制劑，在創面修復過程中可對細胞增殖過程及纖維蛋白凝集作用產生負面影響。21世紀初法國醫生Joseph Choukroun[11]及其團隊提取出第二代血小板濃縮物質PRF，又稱為Choukroun’s PRF，并應用于臨床治療。與PRP對比，PRF制備只需一次離心、耗時短、無添加任何試劑，可長效刺激組織修復并能調節炎癥反應，能夠覆蓋修復小范圍的組織缺損。

1. PRP及PRF的制備方法

2.1 PRP的制備及激活

取靜脈血于含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管中，第一次以低速900 r/min （100 × g，離心10 min）離心。由于血液中各成分比重不同，血漿、血小板、紅細胞可出現分層。下層為紅細胞層，中間層出現白色的薄層含有大量血小板和白細胞，上層為澄清淡黃色血漿層。取血漿和中間層進行第二次離心，以高速3000 r/min （400 × g，離心10 min）離心后，根據密度不同分為 3 層：上層為貧血小板血漿（PPP，Platelet-poor Plasma）層，中間層即為PRP，下層為少量紅細胞，吸取中間層混勻即為 PRP，制備得到的PRP在抗凝狀態下一般可保存8小時[12-13]。應用二次離心法制備 PRP需消耗大量血液，且容易污染，因此臨床制備PRP通常采用血液成分分離自動化設備，在制備較大量PRP的同時，可將紅細胞和血漿回輸給患者。取制備好的PRP約5 ml，加入1ml激活劑(由1ml 10%的氯化鈣與1000 U凝血酶混合制成)，PRP激活后可迅速釋放α顆粒及致密顆粒，這兩種顆粒均可分泌大量生長因子。

2.2 PRF的制備

取靜脈血至無添加劑的玻璃試管內，在血液凝固前應盡快離心，以3000 r/min （400 × g，離心10 min）離心后，試管內可見分為三層。上層為淡黃色PPP，中間層呈白色凝膠狀PRF，下層為紅細胞層。應用此方法制備的PRF所釋放生長因子的量明顯多于其他制備方法[14]。PRF的制膜及保存：取出離心得到的PRF凝膠，因PRF層與紅細胞層交界處含有大量的血小板和白細胞，在去除紅細胞層時應當保留少量紅細胞層[15]。PRF凝膠在除去水分后即可得到PRF薄膜。制膜的方法很多，最常見方法有紗布擠壓法和金屬板重力壓制法。相比較兩種方法，金屬板壓制的PFR膜受力面均勻且可避免紗布上的纖維殘留在PRF膜中，因此金屬板重力壓制法效果更加穩定可靠[16-17]。PRF可在短時間內保存于低溫 4℃的條件下[18]，如需長期保存則可使用冷凍干燥處理技術[19]。

2.3 PRF的幾種亞類

隨著PRF的應用推廣，在標準的PRF制備技術基礎上衍生出L-PRF（leukocyte-PRF）、A-PRF (advanced platelet-rich fibrin)、i-PRF（Injectable Platelet-Rich Fibrin）、T-PRF(titanium-prepared， platelet-rich fibrin) 等幾種亞類。L-PRF在標準PRF制備方法基礎上，將轉速調至2700 r/min并離心12分鐘，可得到富含白細胞的L-PRF。因其富含炎癥細胞釋放炎癥因子，可具有更好炎癥調節作用和抗菌效應[20-21]。將血液置入無菌塑料管中，以1500 r/min轉速離心14分鐘，可得到凝膠遠端富含中性粒細胞的A-PRF[22]，A-PRF更有利于促進單核細胞分化為巨噬細胞，從而分泌生長因子促進骨骼和軟組織再生。Xuzhu Wang等[23]于2017年率先提出i-PRF概念，將血液以700r/min低轉速離心3分鐘可得到一種呈液體狀的i-PRF，這是全新的PRF亞類。在與PRP的動物對比實驗中[24]，i-PRF因含有纖維蛋白和白細胞而更顯著動員細胞遷移促進創面修復。應用鈦合金離心管將血液在3500r/min轉速下離心15分鐘可得到T-PRF[25-26]，T-PRF中的纖維蛋白結構更加穩定，能夠在創面作用更長時間。且通過鈦合金激活的血小板比二氧化硅激活的血小板具有更好的生物相容性。見表1.

表1 PRF的幾種亞型的制備方法及特性

3.血小板濃縮物質的作用機制：

3.1 血小板濃縮物質可釋放大量生長因子

目前已知能夠促進創面愈合的生長因子包括：血小板衍生因子(PDGF，Platelet-Derived Growth Factor)、表皮細胞生長因子（EGF，Epidermal Growth Factor）、成纖維細胞生長因子（FGF，Fibroblast Growth Factor）、胰島素樣生長因子（IGF，Insulin Growth Factor）、血管內皮生長因子（VEGF，Vascular Endothelial Growth Factor）、轉化生長因子-β（TGFβ，Transforming Growth Factor-β）、肝細胞生長因子（HGF，Hepatocyte Growth Factor）等[27]。而血小板濃縮物質可釋放的生長因子種類包括：PDGF、EGF、VEGF、FGF、IGF、TGF-β等，且這些生長因子按人體生物比例釋放可大大提高其利用率及生物效應[28]。PDGF具有PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB 三種亞型，是創面形成時最早分泌的生長因子之一，并作用于創面修復全過程[29]。PDGF通過激活平滑肌細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的有絲分裂，可增加膠原蛋白細胞合成、激活纖維蛋白酶原、促進血管內皮細胞增殖和遷移、加快微血管網的重建及肉芽組織的形成[30-31]，此外PDGF還可促進TGFβ、IGF-1的分泌[32]。EGF主要由血小板脫顆粒分泌，刺激上皮細胞和角質細胞的增殖、分化、遷移。VEGF是調節血管新生、淋巴管生成及血管通透性的關鍵調控因子[34]，對血管內皮細胞具有強烈的旁分泌作用，加速創面肉芽中的血管生成[36-37]。FGF與VEGF具有協同效應，通過刺激成纖維細胞增殖，增加膠原蛋白合成，加速肉芽組織的形成[39]。FGF還可促進TGF-α的分泌，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的局部分泌堆積，在促進組織上皮化的同時可減少增生性瘢痕[40-41]。IGF對細胞有自分泌作用，主要作用于創面的炎癥反應階段，可加強成纖維細胞的分泌功能[43]。TGF-β也有三個不同亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在創面愈合過程中它們幾乎同時出現，但作用卻各不相同。TGF-β1往往以較高濃度存在于創面中，具有炎癥細胞招募作用，可以增強巨噬細胞介導的細胞吞噬、清理功能[45]。TGF-β2幾乎參與創面愈合的所有階段，它通過對炎癥細胞和成纖維細胞的招募作用，促進細胞增殖，誘導血管生成，形成新生肉芽組織[46-47]。TGF-β2通過調節增加I型和III型膠原蛋白分泌，促進疤痕形成。與TGF-β1、TGF-β2促進瘢痕生成不同，TGF-β3能減少膠原蛋白在組織中的堆積，抑制疤痕增生[48]。

3.2 PRF的空間結構作用

傳統濃縮血小板及PRP缺少空間立體結構，血小板短時間內破裂釋放出α顆粒并迅速分泌生長因子，但這種生長因子釋放峰值呈一過性，隨后逐漸減少[49]，創面中血小板的壽命只有五天左右，因此難以長時間維持生長因子的有效濃度[50]。電鏡下觀察發現PRF中纖維蛋白、纖連蛋白和玻連蛋白成疏松立體結構，血小板及白細胞可同時與數條纖維蛋白形成類似半橋粒連接結構，使得血小板內的α顆粒結構穩定[51]。PRF纖維蛋白網狀結構與人類天然組織結構相似，不僅可以延緩內源性纖維蛋白酶降解從而保障血小板長效提供生長因子[52-53]，還可以作為物理結構支架誘導組織細胞爬行與遷移，其疏松的結構也有利于白細胞的滯納及氧氣與營養物質的彌散，更利于免疫細胞發揮抗感染作用[54]。

3.3 血小板濃縮物質的抗菌作用

血小板分泌的抗菌蛋白質包含至少四個家族：細胞因子源性肽、防御素、抗菌肽衍生物、蛋白水解衍生物[55]，血小板α顆粒分泌的抗微生物源性肽、細胞因子源性肽、免疫細胞趨化因子等具有免疫細胞招募效應，通過招募巨噬細胞、中性粒細胞、T 細胞、B 細胞等均可增強創面抗感染能力[56]。血小板的表面及胞內還具有Toll 樣受體、細胞因子IL-1-TLR 受體家族等多種傳感器，并可通過模式識別受體(PRR，Pattern recognition receptor)快速應答創面炎癥反應，在發揮凝血功能的同時可限制細菌擴散，具有直接抗菌作用[57-58]。PRF中高濃度的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞在局部炎性和感染時釋放白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等，可增強組織抗感染能力[59-60]。PRF中的白細胞和血小板，可持續釋放天然抗菌肽(HDP-Host Defense Peptides)，HDP介導的人體免疫反應在發揮抗菌效應的同時可減少細胞毒性，并克服細菌的耐藥性，且HDP對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌以及病毒和真菌均有抗菌活性[61-63]。

4.血小板濃縮物質在脂肪液化創面的治療

4.1 脂肪液化的基本概念

術后切口脂肪液化是手術切口部位脂肪組織細胞受損破裂、壞死、液化的變化過程，其病理機制尚未完全明了，其病理表現為脂肪細胞破裂后脂滴溢出、聚集、伴有無菌性炎癥反應，脂肪液化過程雖無細菌感染，但延長了切口愈合的時間，增加了切口感染的機會。目前我國對脂肪液化切口沒有明確的診斷標準，參考蘇明寶等[64]的診斷標準：①發生于手術后5-7天左右，多數患者切口出現較多滲液，于常規換藥檢查傷口時可見敷料上有淡黃色滲液，擠壓切口周圍皮下組織有較多滲液從切口溢出; ②切口愈合延遲，皮下組織游離，切口滲液中可見大量飄浮脂滴; ③切口及周圍皮膚無明顯紅腫壓痛，切口邊緣及皮下組織無感染及壞死征象; ④取傷口滲出液涂片，鏡下可見大量脂滴，連續3次培養無細菌生長。

4.2 脂肪液化的易患因素

術后切口脂肪液化的高危因素包括肥胖、高頻電刀使用不當、糖尿病、手術切口保護欠妥、縫合方法和縫合技術經驗不足、營養素的缺乏等[65]。而切口脂肪液化的發生往往是以上多個因素綜合作用，造成切口局部血液循環差，血管再生速度減慢，組織修復障礙，從而導致局部脂肪細胞無菌性變性壞死，脂肪細胞破裂后脂滴溢出、聚集，伴有局部無菌性炎癥反應發生。

4.3 脂肪液化創面的治療現況

患者術后切口出現脂肪液化時，早期清除壞死組織及滲液是處理的關鍵，通暢的引流出積液可以避免傷口的感染。目前對于術后切口脂肪液化治療的方法有： 創面局部拆線引流、中醫藥物外敷、光線照射療法、細胞生物因子、負壓創面療法 (NPWT，NegativePressure Wound Therapy)、高滲糖胰島素治療、濕性敷料療法、蝶形膠布牽拉等等。這些種類繁多的治療均需要價格昂貴的醫療設備或耗材，在臨床治療中增加了醫療成本及患者的費用負擔。應用血小板濃縮物質治療脂肪液化切口，因取材均為患者本人血液，無嚴重醫學倫理問題，避免了機體免疫排斥反應，價格低廉、操作簡便安全，能明顯縮傷口愈合時間及較少患者平均住院時間，可有效減輕患者心理與經濟負擔，是治療手術切口脂肪液化的有效方法之一。據我國國內參考文獻數據表明，高娟等[66]應用PRP治療婦產科手術后切口脂肪液化，使患者傷口平均愈合時間縮短42.06%。劉曉韜等[67]應用PRP使胃腸外科、肝膽外科手術后切口脂肪液化的平均愈合時間縮短45.61%，且在治療期間均未有不良事件發生，治療過程安全性較高，具有極高的臨床實用性。

雖然目前尚無PRF應用于臨床脂肪液化創面治療的相關報道，但目前已有離體脂肪組織實驗結果證實利用PRF能夠促進脂肪干細胞（ASCs，Adipose-derived Stem Cells）的增殖與分化[68]，提高局部脂肪細胞和毛細血管的數量及密度，促進脂肪組織局部的血管再生，減少脂肪細胞的凋亡，減少脂肪組織纖維壞死的發生，增加脂肪組織的質量保持率[69]。在臨床應用PRF的傷口治療中，可以觀察到PRF相對于傳統治療方法，可以提高傷口生長因子濃度、修復細胞過度凋亡的情況并促進血管生成及組織修復，同時還具有抗感染的作用，從而加速傷口愈合、縮短治療周期[70]。PRF較PRP更易于獲取，制備方法更簡單，對于術后脂肪液化傷口治療具有巨大研究價值和實用潛力。