女貞子乙醇提取物對人毛囊無色素黑素細胞c-kit表達的影響

（1.河南科技大學第一附屬醫院 皮膚科，河南 洛陽，471000；2.洛陽市第二中醫院皮膚科，河南 洛陽，471003）

白癜風是皮膚科常見多發難治性色素障礙性疾病，嚴重影響患者皮膚外觀美容，導致患者極大的精神壓力和沉重的經濟負擔。白癜風的病因和發病機制十分復雜，至今仍未明確[1]。目前西醫治療白癜風方法很多，如光化學療法，免疫療法、自體表皮移植及黑素細胞移植等[2]，但療效不理想或有一定副作用，存在著較大的局限性。相比之下，某些中藥制劑在白癜風治療方面已取得了令人滿意的效果 ，但具體作用機制研究較少。女貞子具有滋補肝腎，明目烏發的功能。藥理研究表明女貞子具有護肝、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老等作用[3]，還可上調酪氨酸酶活性，促進黑素合成。干細胞因子(SCF)及其受體c-kit對黑素細胞的分化、增殖、遷移具有重要作用。前期研究顯示，與正常對照組相比，白癜風皮損毛囊無色素黑素細胞（AMMC）上c-kit表達顯著減少，提示白癜風皮損毛囊SCF/c-kit信號通路可能存在異常受損從而致黑素細胞功能失調[4]。鑒于此，本研究旨在探討女貞子乙醇提取物對人毛囊無色素黑素細胞c-kit表達的影響，并以此為切入點，探討白癜風的治療新途徑。

1 試劑與材料

1.1 研究材料

皮膚標本取自人正常頭皮(河南科技大學第一附屬醫院急診外科提供)，4℃環境下以DMEM培養基貯存，貯存時間不超過48h。

1.2 主要研究試劑

兔抗人酪氨酸激酶受體抗體、B-actin抗體、鼠抗人T311酪氨酸酶單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(杭州吉諾)，中性蛋白分離酶(dispase)(廣州威佳)，M254培養基、人黑素細胞生長添加劑(HMGS)、Transwell培養板(美國Cascade)，即用型SP免疫組化試劑盒(福建邁新)，RNase(上海瑞齊)，瓊脂糖凝膠(上海艾研)，Trizol(美國Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 中藥提取

參照李永偉等[5]制定的方法。

2.2 毛囊無色素黑素細胞培養

參照王大光等[6]制定的方法進行。

2.3 細胞增殖

參照李永偉[7]方法，配制0，2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL含女貞子乙醇提取物濃度的TICVA培養基。無色素黑素細胞用dispase酶消化傳代后第2天加入所配培養基于24孔培養板培養，每個濃度設4個復孔，72 h后Coulter Counter計數，確定最佳濃度。然后加入現配XTY/PMS顯色液，490 nm波長下檢測各孔吸光度(A值)。

2.4 c-kit 表達

以每孔1×105個，將培養液接種于6孔培養板，37℃環境下培養24 h后，去除上清，加入女貞子提取物，培養72 h終止。同時設立空白對照組，僅添加M254完全培養基。設計PCR引物[8]，RT-PCR測定c-kit mRNA的相對表達量。

2.5 統計方法

采用SPSS23.0軟件，采用重復測量方差分析或獨立樣本 檢驗， P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞增殖

重復測量方差分析結果顯示，培養72h后，濃度為2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL女貞子乙醇提取物對毛囊無色素黑素細胞的增殖具有促進作用(F=9.34，P＜0.01)，其中0.22mg/mL促進作用最為顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度女貞子提取物對毛囊無色素黑素細胞的促增殖作用(n=10)

3.2 c-kit表達

對照組c-kit mRNA表達值為(0.125±0.023)，而0.22mg/mL組為(0.647±0.046)，組間比較差異有統計學意義(n=10， =-32.096，P＜0.001)。

4 討 論

祖國醫學認為，白癜風病因病機主要為“肝腎不足”，肝腎不足則“皮毛膝里失養而發白斑”，因此臨床多采用“補益肝腎”法治療。女貞子具有滋補肝腎，明目烏發的功能，其主要有效成分為酪醇和齊墩果酸，其中酪醇具有較強的抗氧化、抗疲勞、抗毒、抗微波輻射等護體強健功效，而齊墩果酸則可抗炎、抗病毒、抗氧化、抗突變、增強肌體免疫力。女貞子提取物可誘導黑素細胞內肌動蛋白細胞骨架的聚合，促進黑素細胞的黏附及遷移。

臨床觀察顯示，白癜風復色時多是先從白斑毛囊口出現色素沉著，漸向外周擴展，最后融合成片；表明白癜風復色主要是皮損區毛囊黑素細胞的增殖和遷移。近年來，通過對毛囊外毛根鞘無色素黑素細胞的解剖結構、形態學、體外活化黏附和移行方面都進行研究，認為毛囊無色素黑素細胞位于外毛根鞘的中下段，形態類似于周邊的毛皮質細胞，外觀胞體偏圓，樹突不明顯，數目較少，常成群集中分布，胞質中充滿黑素體，多為Ⅱ、Ⅲ期黑素小體，其形態結構的變化導致功能上的不成熟。毛囊無色素黑素細胞是靜止狀態的黑素細胞，是表皮黑素細胞的干細胞和儲庫，能夠為特定因素所激活，分化增殖從無活性狀態慢慢成熟為有活性狀態并沿著外毛根鞘遷移到附近的表皮，形成色素島，在白癜風復色過程中有著極為重要的作用，而SCF/c-kit信號轉導途徑對黑素細胞的分化、增殖、遷移均具有關鍵作用[9]。

在本研究中，我們通過設置不同濃度的女貞子乙醇提取物，研究其對無色素黑素細胞的作用。結果顯示，不同濃度的女貞子提取物均可促進無色素黑素細胞的增殖。進一步進行RT-PCR測定c-kit mRNA的相對表達量顯示，與對照組相比較， 0.22mg/mL的女貞子提取物的c-kit mRNA的相對表達量具有顯著優勢，為(0.647±0.046)。

我們前期研究顯示[10]，白癜風皮損毛囊AMMC上c-kit表達顯著減少，提示白癜風皮損毛囊SCF/c-kit信號通路可能存在異常受損從而致黑素細胞功能失調。而結合本次研究結果，我們認為女貞子乙醇提取物有可能是通過SCF/c-kit信號途徑激活毛囊外毛根鞘的無色素黑素細胞，使其分化增殖并遷移至表皮基底層而發揮治療白癜風的作用。