牛磺熊去氧膽酸預防高脂飲食小鼠膽囊結石的研究

陸啟帆， 蔣兆彥， 王啟晗， 趙 剛， 胡 海

（同濟大學附屬東方醫院膽石病中心，上海 200120）

膽石病是全世界常見的消化系統疾病之一,近年來發病率逐年上升。膽結石按種類可分為膽固醇結石、膽色素結石及混合性結石。超過90%的膽結石由膽固醇組成,并在膽囊內形成。有研究表明高脂飲食可影響小鼠的腸道菌群結構，而腸道菌群結構的改變則會影響小鼠血清及肝臟的脂質含量［1］。牛磺熊去氧膽酸 (tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)作為一種膽石病治療藥物，可有效降低膽囊膽汁的膽固醇含量，降低膽囊結石的成石率［2］，并增加膽囊膽汁中的膽汁酸含量，防止膽囊膽固醇結石的形成。關于TUDCA降低膽囊結石成石率，多數文獻指出，是增加膽汁酸量，改變肝臟膽固醇代謝所致。本研究通過體視鏡觀察，腸道菌群結構分析及定量實時聚合酶聯反應 (quantitative real time polymerase chain reaction，q-PCR)等方法，檢測小鼠的膽囊結石形成情況，腸道菌群結構變化,及肝臟、腸道中脂質和膽汁酸代謝相關基因的變化，以探討TUDCA通過改變高脂飲食小鼠腸道菌群結構達到降低成石率的目的。

材料與方法

一、材料

健康雄性SPF級c57bl/6小鼠30只，4周齡，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。ABI Q6 Flex熒光q-PCR系統，Trizol總RNA提取試劑購自ThermoFisher Scientific(批號176407)，逆轉錄試劑盒購自ThermoFisher Scientific(批號00634069)，膽固醇檢測試劑盒購Roche Diagnostics GmbH(批號31851101)，三酰甘油檢測試劑盒購自Roche Diagnostics GmbH(批號34174001)，磷脂檢測試劑盒購自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation(批號AQQ6933)，膽汁酸檢測試劑盒購自Randox Laboratories Ltd(批號 416850)。

二、方法

(一)動物模型制備

小鼠普通飼料喂養1周后，隨機分為兩組：給予成石飼料(lithogenic diet，LD)(普通飼料98.25%+1.25%膽固醇+0.5%膽鹽)，為LD組(15只)；給予預先配比混有TUDCA的飼料 (TUDCA 5 g/kg LD)，為TUDCA組(15只)。每只籠內飼養5只。動物均在實驗室標準條件下生長(光照和黑暗各12 h，21℃～24℃，濕度 50%～55%)。每天每籠給予20 g飼料，喂養8周。

(二)組織樣本采集

喂養8周后，使用4%水合氯醛麻醉。摘取眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，固定于取樣臺。取膽囊、肝臟、小腸，放入凍存管液氮凍存，-80℃冰箱保存。

(三)總 RNA提取

取50 mg肝臟及小腸組織置于凍存管中，加入500μL Trizol液，徹底勻漿后轉移至新的離心管中，加入500μL Trizol液及200μL氯仿，劇烈震蕩混勻后4℃離心，12 000轉/min，5 min，將離心后的上層水相轉入新離心管中，加入500μL異丙醇并混勻后，4℃離心，12 000轉/min，10 min，棄去上清液，用無水乙醇及DEPC水配成的75%乙醇1 mL洗滌沉淀，用DEPC水溶解沉淀并調整濃度至200 mg/L即為用于逆轉錄的總RNA。

(四)q-PCR檢測

應用q-PCR法，以GAPDH為內參，檢測兩組小鼠肝臟 Abcg5、Abcg8、Abcb11、Acat2、Cyp27、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及小腸 Hmgcr、Npc1L1、Fgf15(中英文全稱見后)mRNA表達水平。將提取得到的總RNA取2μg按照Thermo Fisher逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄得到cDNA。所有檢測基因的引物序列見表1。

(五)腸道菌群結構分析

收集第8周小鼠的糞便共計30份，提取其中微生物總DNA。針對16 SrDNA基因V4區合成特有引物，行PCR擴增并完成文庫構建。在MiSeq平臺進行測序與分析。

(六)肝臟脂質提取和測定

取50 mg小鼠肝臟，切碎后置于試管。每管加入3 mL Folch液(三氯甲烷∶甲醇=2∶1)4℃過夜。然后轉移至新試管，另加1 mL Folch液淋洗。將1 mL淋洗液再加入。按照檢測種類不同，吸取不同量液體(總膽固醇100μL，三酰甘油50μL)至新試管中，57℃恒溫干燥。按照膽固醇及三酰甘油檢測試劑盒說明書測定。

(七)膽汁酸檢測

取膽囊膽汁，滴入干凈的離心管中。膽汁經甲醇稀釋后，分別使用膽汁酸檢測試劑盒以及磷脂檢測試劑盒進行測定。膽囊膽汁膽固醇飽和指數則通過Carey表計算得出。

三、統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。所有數據以均數±標準差表示，采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、成石率及肝臟病理改變結果

在體視鏡下觀察可知，LD組小鼠膽囊中均可見圓潤成型的膽固醇結石同時伴有大量的膽固醇結晶(見圖 1A、B)，成石率 100%。TUDCA組小鼠膽囊則呈現為清澈透亮狀(見圖2A、B)，并未發現有成型的膽固醇結石，僅在其中3只小鼠膽囊內發現少量散在結晶(見表2)。HE染色的小鼠肝臟病理切片，發現LD組肝臟出現嚴重的脂肪變形(見圖3)，而TUDCA組肝臟細胞形態良好(見圖4)。

表2 小鼠膽囊大體情況

二、肝臟與血清脂質檢測結果

為進一步分析TUDCA對于膽固醇代謝的影響，實驗檢測了兩組小鼠肝臟以及血清的脂質含量(見圖5A、表3)。結果發現與LD組相比，TUDCA組小鼠血清的總膽固醇、高密度脂蛋白(high-density lipoproteins,HDL)膽固醇及低密度脂蛋白(lowdensity lipoproteins,LDL)膽固醇含量均顯著下降(P＜0.01)。同時兩組小鼠肝臟的脂質含量檢測發現，與LD組相比，TUDCA組肝臟的三酰甘油及膽固醇含量顯著下降(P＜0.01)(見圖5B、表4)。

圖1 LD喂養小鼠8周后的肝臟及膽囊

圖2 LD+TUDCA喂養小鼠8周后的肝臟及膽囊

表3 血清脂質含量檢測（mmol/L）

表4 肝臟脂質檢測（mg/g）

表1 相關指標引物序列

圖3 LD喂養小鼠8周后的肝臟病理切片（HE，×20）

圖4 LD+TUDCA喂養小鼠8周后的肝臟病理切片（HE，×20）

三、TUDCA治療后小鼠腸道菌群的變化

圖5 肝臟及血清脂質檢測結果

對小鼠盲腸內容物的菌群測序顯示，TUDCA組腸道厚壁菌門豐度較LD組增加，而擬桿菌門豐度則降低(見圖6A、B、C)，厚壁菌門/擬桿菌門比值上升3.13倍(見圖6D)，兩組腸道菌群比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)(見表5)。

表5 腸道菌群

四、小腸脂質及膽汁酸代謝相關基因檢測結果

與小腸膽固醇轉運蛋白有關的關鍵蛋白Npc1L1(Niemann piok typec1 like1)、ATP 結合盒 G5(ATPbinding cassette,Abcg5)和G8(ATP binding cassette,Abcg8)基因的mRNA表達量在兩組間差異均無統計學意義 (P＞0.05)。但與LD組比較，TUDCA組的小腸中3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase,Hmgcr)的表達下降(P＜0.05)(見表 6、圖7A)。 此外，成纖維細胞生長因子15(fibroblast growth factor 15,Fgf15)表達在TUDCA組顯著上升(P＜0.001)(見表6、圖 7B)。

五、肝臟脂質及膽汁酸代謝相關基因檢測結果

與LD組比較，TUDCA組肝臟Abcg5及Abcg8基因表達量均有所下降，同時TUDCA組肝臟的膽汁酸轉運基因Abcb11(ATP binding cassette subfamily B member 11)表達量則顯著上升。實驗還發現，TUDCA組肝臟的乙酰輔酶A乙?；D移酶2(acetyl-coenzyme A acetyltransferase 2,Acat2)表達量也有所上升。與LD組相比，TUDCA組肝臟的膽汁酸合成限速酶Cyp27(sterol 27-hydroxylase)的表達量也明顯上升。兩組比較其差異均有統計學意義(P＜0.05)(見圖 8A、表 7)。與 LD 組比較，TUDCA 組肝臟TNF-α表達量顯著下降(見圖8B)。

表6 小腸組織q-PCR檢測結果

六、兩組小鼠膽囊膽汁成分測定

實驗檢測兩組小鼠的膽囊膽汁成分發現(見圖9)。與LD組相比，TUDCA組小鼠膽囊膽汁內的膽固醇、磷脂、總脂質含量及膽固醇飽和指數均明顯下降，同時膽囊膽汁內的膽汁酸含量則明顯上升。兩組比較差異均有統計學意義(見表8)。

討 論

一、TUDCA降低膽囊結石的發生率

圖8 小鼠肝臟膽固醇及膽汁酸代謝相關基因檢測

圖9 小鼠膽囊膽汁成分測定

表8 膽囊膽汁成分檢測結果

膽囊膽固醇結石的形成與膽囊膽汁膽固醇過飽和導致的膽固醇析出形成膽固醇結晶有關［3］。本研究發現，TUDCA可顯著預防小鼠膽囊膽固醇結石的形成，僅3只小鼠見膽囊膽汁內膽固醇結晶。這與使用TUDCA后降低膽囊膽汁膽固醇飽和指數有關。在臨床上，TUDCA治療也具有明顯降低體內膽固醇含量的作用［4］。本研究結果顯示，TUDCA治療后小鼠血清及肝臟膽固醇含量均顯著降低，且肝臟脂肪浸潤明顯改善，表明TUDCA具有降低高膽固醇飼料喂養小鼠整體的膽固醇含量效應。

二、TUDCA影響體內膽固醇代謝

膽汁酸是膽汁的主要成分之一，是具備親水性和疏水性的兩性分子，按照特性不同可分為親水性膽汁酸及疏水性膽汁酸。親水性膽汁酸可穩定肝細胞膜，拮抗疏水性膽汁酸的細胞毒性作用。TUDCA作為親水性膽汁酸的代表，具有降低小腸膽固醇吸收的效應［5］，進而減少機體對飲食膽固醇的攝取，降低膽固醇負荷。 此外，Mueller等［6］研究發現短期使用UDCA尚可促進膽汁酸合成和膽固醇轉化。本研究顯示，膽汁酸合成關鍵酶Cyp27表達上升，可能反映TUDCA治療后對膽汁酸合成的促進效應。Abcg5和Abcg8是肝臟膽小管側膜分泌膽汁膽固醇的關鍵轉運蛋白。筆者發現TUDCA治療后顯著降低Abcg5和Abcg8在小鼠肝臟的表達，因而對于降低肝細胞向膽汁分泌膽固醇，降低膽汁膽固醇飽和指數有重要作用，與TUDCA組膽結石形成的減少密切相關。

三、TUDCA通過改變腸道菌群豐度與分布降低成石率

小腸作為吸收和合成膽固醇的場所之一，高膽固醇飲食將會影響腸道菌群的豐度與分布，進而導致腸道對于脂質的吸收增加及全身肥胖［7］。有文獻指出膽結石病人腸道菌群結構與正常人顯著不同，改變腸道菌群結構會增加膽囊結石患病的易感性［8-9］。改善腸道菌群結構則有助于肝臟膽固醇轉化為膽汁酸及抑制血清及肝臟內膽固醇積聚，并進一步降低膽囊膽汁膽固醇含量。Hildebrandt等［10］研究發現，給予小鼠高脂飼料即高膽固醇、無膽酸飼料喂養時，小鼠腸道內變形菌門數量上升。筆者團隊既往研究發現，給予小鼠成石飼料即含有高膽固醇、低濃度膽酸飼料喂養時，與普通飼料相比，小鼠腸道內厚壁菌門/擬桿菌門比值下降、膽囊結石形成［11］。Islam等［12］通過給予大鼠含高濃度膽酸(2 g膽酸/kg飼料)的飼料10 d后發現，小鼠腸道內厚壁菌門占比增加而擬桿菌門占比減少。筆者給予小鼠飼料(5 gTUDCA/kg LD)后，小鼠腸道菌群結構中厚壁菌門豐度占比上升，而擬桿菌門豐度占比下降，TUDCA組厚壁菌門/擬桿菌門比是成石組的3.13倍。筆者認為造成高脂飼料、高脂+低濃度膽汁酸飼料及高脂+高濃度膽汁酸飼料之間腸道菌群結構差異的原因可能是，膽汁酸對于腸道細菌具有強烈的選擇性，高濃度膽汁酸抑制了腸道中部分不耐受膽汁酸的細菌增殖。Wang等［13］研究發現，經熊去氧膽酸處理后，高脂飼料喂養的大鼠血清及肝臟脂質含量明顯下降。本研究發現，TUDCA處理后的小鼠血清及肝臟脂質含量也明顯下降，同時，小鼠腸道內的膽固醇轉運蛋白Npc1L1、Abcg5、Abcg8基因的 mRNA表達量在兩組間差異均無統計學意義。這表明TUDCA減少血清以及肝臟脂質含量的方式并不是通過抑制小腸膽固醇轉運。Degirolamo等［14］研究發現，腸道中厚壁菌門數量的上升可通過上調Cyp7及Cyp27的表達來增加肝臟膽汁酸的合成。Jia等［15］研究發現，腸道菌群數量上升產生大量膽汁酸水解酶，在腸道內將結合膽汁酸水解為大量次級膽汁酸：石膽酸(lithocholic acid,LCA)及脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)，而G蛋白膽汁酸偶聯受體5則受LCA及DCA的激活抑制肝臟膽汁酸的合成。Juste［16］研究發現，腸道內的膽汁酸水解酶主要由擬桿菌門細菌產生，而本研究發現，經TUDCA處理后，腸道擬桿菌門占比由LD組中的25.70%顯著下降至TUDCA組中的10.67%。 Hu等［17］研究發現，LD飼料中高水平膽固醇含量可顯著增加腸壁通透性，導致細菌脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)過量入血，從而導致TNF-α表達上升、膽固醇積聚和肝臟損傷。本研究發現，TUDCA組肝臟TNF-α的表達量顯著下降，在大體及RNA水平均顯示肝臟損傷減輕，表明LPS入血減少。由于高濃度膽汁酸對于腸道菌群強烈的選擇性抑制作用，使用TUDCA處理后上調厚壁菌門在腸道菌群中的比例，下調腸道菌群中擬桿菌門的比例，降低腸道菌群的豐度，同時減少菌群分泌LPS的入血，最終增加肝臟膽汁酸的合成、減少小鼠體內血清及肝臟的膽固醇積聚。這與本研究發現的小鼠膽囊膽汁膽汁酸含量上升，血清及肝臟膽固醇含量顯著下降的結果一致。機制簡圖見圖10。

綜上所述，本研究表明TUDCA預防小鼠膽囊膽固醇結石形成，其機制包括：①通過增加膽汁酸親水性，抑制小腸膽固醇吸收和肝臟膽固醇負荷，降低肝臟Abcg5和Abcg8表達,以減少分泌膽汁中的膽固醇，進而降低膽固醇飽和指數；②TUDCA因其親水特性，降低膽汁中膽汁酸的疏水指數，進而增加膽固醇在膽汁中的溶解度；③TUDCA可增加腸道厚壁菌門比例、降低擬桿菌門的比例，可能促進膽汁酸合成，并減少LPS入血造成肝臟炎癥。

圖10 TUDCA降低膽囊膽固醇結石成石率的機制簡圖