單學時完成PCR與瓊脂糖電泳實驗的探索

楊柯金

(河南省南陽師范學院生命科學與技術學院 南陽 473061)

1 目前存在的問題

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)與瓊脂糖電泳是分子生物學和基因工程實驗中的常規實驗[1,2]。一次實驗課的課時為1～3學時(45min～2h)，常規PCR反應至少需要1.5～2h；瓊脂糖電泳中制膠、制樣、點樣、電泳等過程至少需要1h；實驗原理、操作步驟的講述、學生動手操作、結果點評等過程至少需1h；總體一次PCR與瓊脂糖電泳實驗需要4h，無法滿足教學需要。

2 問題解決途徑

通過改良PCR反應體系、縮短儀器運行及電泳時間，從而做到在單學時內順利完成PCR及電泳實驗，以便教師有足夠的時間可充分解釋實驗原理、總結實驗結果，幫助學生提高分析、解決問題的能力，滿足PCR與電泳實驗的教學需求，提高實驗教學效果。

2.1 改良PCR反應體系，減少加樣種類 常規PCR反應體系包括PCR反應緩沖液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、一對引物、模板DNA、 H2O，反應需加7種試劑。本實驗選用2×EasyTaq? PCR SuperMix試劑，該試劑包括了PCR擴增所需的反應緩沖液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶4種試劑，用表1反應體系、只需要加4種試劑，縮短了加樣過程，更方便學生操作。

2.2 減小擴增目的片段的大小，縮短單次循環反應時間 吊蘭是常見的室內觀賞植物，實驗用吊蘭基因組DNA(gDNA)作模板，取材方便。用吊蘭gDNA做模板，引物序列(表1)參考于典司博士論文[3]，擴增出來的DNA總長315bp。由于擴增的片斷較小，變性、退火、延伸時間均由原來的30～60s降低為10s(表2)，PCR產物經1%瓊脂糖電泳后均可發現明亮、單一擴增條帶(圖1A—1D)，表明該實驗參數可用于基因片段的擴增。

表1 PCR反應體系

(注： 引物F： AGGTCTTTTTCCCTGTATCC，引物R： GATTGGCTTTCCATTTACTG)

表2 PCR反應循環參數

2.3 降低循環圈數，縮短總體反應時間 PCR循環圈數也是影響反應時間的一個關鍵因素，常規的循環圈數為35～40，通過設置20、 25、 30、 35、 40個不同的循環圈數，發現循環圈數為20時，24min即可完成PCR擴增，且經檢測發現，PCR產物條帶明亮(圖1A—1D, 1)，可滿足學生實驗的需求。

2.4 增大電壓、縮短電泳時間 瓊脂糖電泳電壓要求為3～5V/cm，用150V電壓，分別電泳5、 10、 15、 20min(圖1)，發現，電泳10min后DNA marker中的100bp、 250bp、 500bp的條帶可明顯區分開，本實驗設計擴增的片段為315bp，界于250～500bp之間，電泳10min足夠用來觀察條帶，判斷其位置(圖1B)。

2.5 染料加入瓊脂糖凝膠中，省略染色過程 常用的染色步驟有兩種： 一種是先電泳，后染色；一種是將染料放入瓊脂糖凝膠中，邊電泳邊染色。常用的DNA染料為EB, EB為強誘變劑，具有高致癌性，本實驗選用相對較安全的染料GelRed，采用將該染料加入瓊脂糖凝膠中的方法進行DNA染色，既相對安全，又節省了時間。

圖1 不同循環環數、不同電泳時間PCR產物(注： A～D分別為電泳5min (A)、電泳10min (B)、電泳15min (C)、電泳20min (D)結果；1～5分別為PCR循環圈數20、 25、 30、 35、 40的PCR產物；M為Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker)。

3 教學反思

通過以上改良，選用表1的反應體系、選用表2的反應參數，用GelRed做染料加入瓊脂糖凝膠中，150V電泳10min，最終可以在34min完成PCR反應及電泳實驗，且實驗結果可滿足學生實驗。

在快速完成該實驗的過程中，以下幾個問題值得關注： 首先，PCR實驗中需要不同量程的微量移液器，該裝備價格相對較高，且如果使用不當，極易損耗，如何讓每一位學生都能正確、熟練運用微量移液器是一個值得探究的問題；其次，本實驗中需要2×EasyTaq? PCR SuperMix和毒性相對小的GelRed為DNA染料，該染料價位相對較高，必使實驗經費增加；最后，該實驗操作步驟較多，學生是否具有較強的動手能力也是影響本實驗在有效時間內順利完成的一個關鍵因素，如何在有限的時間內提高學生的動手能力是一個值得關注的問題。

(基金項目： 河南省高等教育教學改革研究與實踐項目“網絡時代地方高師院校生科師范生教師專業實踐能力培養的研究與實踐”，No.2017SJGLX425)

*前文受翰思科學儀器公司關注*