KIM-1在TGF-β1誘導的大鼠腎小管上皮細胞纖維化因子表達中的作用

劉波 王萍 李霞 張杰 李麗

(1兗礦集團有限公司總醫院腎內科，山東 鄒城 273517；2濟寧醫學院附屬醫院腎內科)

肥胖、糖尿病、高血壓等均會引起慢性腎臟疾病發生，腎小管間質纖維化是慢性腎臟疾病發展到終末期的共同特征，腎間質纖維化的發生與腎小管上皮細胞上皮間質轉化(EMT)有關，在此過程中，上皮細胞標志特征逐漸消失，細胞開始表達α-平滑肌肌動蛋白(SMA)〔1，2〕。腎小管上皮細胞纖維化發生的誘導因素有很多，其中轉化生長因子(TGF)-β1是重要的誘發因子，也是常用的體外研究腎小管上皮細胞纖維化的誘導因子〔3〕。腎臟損傷因子(KIM)-1是一種跨膜蛋白，可以反映腎功能的變化，在腎損傷中具有重要意義〔4，5〕。研究顯示，KIM-1在腎纖維化組織中表達上調，并且可以用于判斷腎功能的損傷情況〔6〕。本實驗探討KIM-1在TGF-β1誘導腎小管上皮細胞纖維化和EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 大鼠腎小管上皮細胞NRK52E購自成都正能生物；TGF-β1購自美國Pepreotech；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；BCA蛋白檢測試劑盒電化學發光(ECL)試劑盒購自美國Pierce；辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白(Ig)G購自美國Jackson；上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體、α-SMA抗體購自美國BD；結締組織生長因子(CTGF)抗體、1型膠原酶(Col1)抗體、3型膠原酶(Col3)抗體購自美國Abcam；熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物。

1.2細胞培養和分組 大鼠腎小管上皮細胞NRK52E培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中，在37℃，5% CO2培養箱內培養。NRK52E細胞分為：對照組、對照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1，對照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細胞分別用TGF-β1刺激，刺激方法為：在細胞培養液中添加10 ng/ml的TGF-β1繼續孵育72 h。陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細胞在TGF-β1刺激前，分別轉染siRNA對照和KIM-1 siRNA，細胞轉染用脂質體轉染法，具體步驟同Lipofectamine 2000轉染試劑說明書。

1.3qRT-PCR法檢測 TGF-β1刺激后的腎小管上皮細胞中KIM-1的表達水平 對照組、對照組+TGF-β1細胞處理方法同上，提取細胞的RNA，步驟簡述如下：在細胞中添加TRIZOL，用移液槍反復吹打混合后，轉移到離心管中，以低溫4℃，離心10 min，棄上清，加入三氯甲烷，上下顛倒混合后，置于冰上孵育15 min，低溫4℃，離心10 min，吸取上清溶液，與異丙醇混合沉淀RNA，乙醇洗滌，用DEPC水溶解。取RNA，在72℃變性約10 min后，42℃孵育60 min，95℃孵育5 min，逆轉錄合成cDNA。取cDNA，用熒光定量PCR測定計算KIM-1 mRNA水平，步驟同熒光定量PCR試劑盒。

1.4Western印跡法檢測TGF-β1刺激后的腎小管上皮細胞中KIM-1的表達水平 對照組、對照組+TGF-β1細胞處理方法同上，用PBS洗滌3次以后，在細胞中添加細胞裂解液，在冰上裂解30 min后，置于低溫4℃離心10 min，吸取上清，保存在-80℃。用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣品，以每個泳道添加30 μg蛋白樣品進行蛋白電泳，電泳用10%的分離膠、5%的濃縮膠。上樣前，把蛋白樣品與上樣緩沖液在100℃孵育5 min。用轉膜儀把蛋白轉移到PVDF膜上，電流調整為350 mA。用5%脫脂奶粉封閉后，再分別與一抗和二抗反應，一抗以1∶600稀釋，二抗以1∶2 000稀釋。ECL顯色，Alpha-view對蛋白進行定量分析。

1.5Western印跡檢測細胞中EMT標志蛋白E-cadherin、α-SMA和纖維化因子CTGF、Col1、Col3的表達 對照組、對照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細胞處理方法同上，用Western印跡法檢測細胞中EMT標志蛋白E-cadherin、α-SMA和纖維化因子CTGF、Col1、Col3的表達，E-cadherin、α-SMA一抗以1∶800稀釋，CTGF、Col1、Col3一抗以1∶1 000稀釋。步驟同上。

1.6統計分析 應用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1KIM-1在TGF-β1作用后的腎小管上皮細胞中表達上調 對照組+TGF-β1細胞中KIM-1蛋白和mRNA水平均顯著高于對照組(P<0.05)。TGF-β1誘導腎小管上皮細胞表達KIM-1。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測KIM-1在TGF-β1作用后的腎小管上皮細胞中的表達

組別KIM-1 mRNAKIM-1蛋白對照組1.00±0.000.28±0.02對照組+TGF-β14.36±0.241)0.97±0.051)

與對照組比較：1)P<0.05

2.2轉染KIM-1 siRNA后的腎小管上皮細胞中KIM-1蛋白和mRNA水平表達下調 干擾組+TGF-β1細胞中KIM-1蛋白和mRNA水平較對照組+TGF-β1顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細胞中KIM-1蛋白和mRNA水平與對照組+TGF-β1比較差異無統計學意義(P>0.05)。KIM-1 siRNA成功下調了腎小管上皮細胞中KIM-1的表達和轉錄。見圖2、表2。

圖2 Western印跡測定轉染KIM-1 siRNA后的腎小管上皮細胞中KIM-1蛋白表達

組別KIM-1 mRNAKIM-1蛋白對照組+TGF-β11.00±0.000.93±0.11陰性組+TGF-β10.98±0.130.95±0.14干擾組+TGF-β10.41±0.061)0.36±0.051)

與對照組+TGF-β1比較：1)P<0.05

2.3下調KIM-1抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT 與對照組比較，對照組+TGF-β1細胞中E-cadherin蛋白表達顯著下調，α-SMA蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與對照組+TGF-β1比較，干擾組+TGF-β1細胞中E-cadherin蛋白水平顯著升高，α-SMA蛋白水平顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細胞中E-cadherin、α-SMA蛋白與對照組+TGF-β1比較，差異無統計學意義(P>0.05)。TGF-β1誘導腎小管上皮細胞EMT，而下調KIM-1可以減弱TGF-β1對腎小管上皮細胞EMT的誘導作用。見圖3、表3。

組別E-cadherinα-SMA對照組0.83±0.090.25±0.04對照組+TGF-β10.48±0.071)0.75±0.091)陰性組+TGF-β10.46±0.080.73±0.05干擾組+TGF-β10.67±0.072)0.60±0.052)

與對照組比較：1)P<0.05；與對照組+TGF-β1比較：2)P<0.05，下表同

2.4下調KIM-1抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞表達纖維化因子CTGF、Col1、Col3 與對照組比較，對照組+TGF-β1細胞中CTGF、Col1、Col3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與對照組+TGF-β1比較，干擾組+TGF-β1細胞中CTGF、Col1、Col3蛋白水平顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細胞中CTGF、Col1、Col3蛋白與對照組+TGF-β1比較，差異無統計學意義(P>0.05)。TGF-β1誘導腎小管上皮細胞表達纖維化因子CTGF、Col1、Col3，而下調KIM-1可以減弱TGF-β1對腎小管上皮細胞表達CTGF、Col1、Col3的誘導作用。見表4、圖4。

圖4 Western印跡檢測下調KIM-1后的腎小管上皮細胞纖維化因子的表達

組別CTGFCol1Col3對照組0.35±0.030.25±0.020.12±0.03對照組+TGF-β10.69±0.051)0.52±0.061)0.28±0.021)陰性組+TGF-β10.68±0.090.53±0.080.29±0.04干擾組+TGF-β10.46±0.052)0.40±0.042)0.19±0.032)

3 討 論

KIM-1蛋白含有一個6個半胱氨酸構成的球蛋白和黏液素的功能區域連接而成的結構域，在正常的腎臟組織中表達水平極低，在損傷后的腎組織中異常升高〔7，8〕。KIM-1水平與患者腎組織損傷程度的診斷、預后等有關〔9〕。KIM-1可以誘導急性腎損傷大鼠腎小管上皮細胞發揮清除組織碎片的作用，而清除組織碎片有利于腎小管重構，KIM-1是急性腎損傷發生后炎癥反應的關鍵環節〔10，11〕。同樣在慢性腎損傷中發現，KIM-1表達明顯的區域腎小管損傷嚴重，腎纖維化程度高，KIM-1與慢性腎臟疾病有關〔12，13〕。研究顯示，TGF-β1刺激后的腎小管上皮細胞中KIM-1表達水平升高，KIM-1可能參與腎小管上皮細胞纖維化的發生〔14〕。本實驗的結果顯示，TGF-β1處理以后的腎小管上皮細胞中KIM-1的轉錄和表達水平均升高，這與上述報道相符合。上皮細胞黏附在基底膜上，是一種極性細胞，其側面可以與鄰近的上皮細胞相互作用，形成類似于鋪路石樣的形態，而間充質細胞可以分化為多種不同的間質細胞，在胚胎的發育中具有重要作用〔15〕。EMT主要表現為上皮細胞形態特征減弱，逐漸與基底膜分離，并獲得間質細胞的標志，在心肌纖維化、腎組織纖維化、癌癥轉移等疾病的發生中有重要作用〔16〕。腎小管上皮細胞EMT的發生與腎組織的損傷有關，如腎小球腎炎、高血壓、糖尿病腎病等，研究表明，在不同原因引起的腎組織損傷中均發現有不同程度的腎小管EMT，并且EMT發生水平不僅與血肌酐水平等相關，還與腎纖維化的程度及預后有關〔17〕。本實驗結果顯示，TGF-β1處理后的腎小管上皮細胞EMT水平升高，而敲低KIM-1可以抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT，提示KIM-1在腎小管上皮細胞轉分化中具有重要作用。

腎組織纖維化與細胞分泌的多種纖維化因子的表達有關，CTGF是由349個氨基酸組成的多肽，屬于一種生長因子，參與細胞外基質、細胞黏附、有絲分裂等過程，在腎纖維化中發揮促進作用，在多種原因引起的腎損傷中表達上調〔18〕。Col1、Col3過度表達是腎纖維化發生的重要原因，其表達水平升高后可以促進腎小管上皮細胞纖維化〔19〕。研究表明，TGF-β1作為一種重要的腎纖維化誘發因子，可以促進腎小管上皮細胞中Col1、Col3、CTGF的表達〔20〕。本實驗結果表明，敲低KIM-1可以抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞表達Col1、Col3、CTGF，敲低KIM-1具有抑制腎小管上皮細胞纖維化的作用。

KIM-1在腎纖維化中表達上調，在TGF-β1誘導腎小管上皮細胞纖維化中表達升高，敲低KIM-1的表達水平可以抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT和表達纖維化因子，KIM-1可能是一個潛在的干預腎間質纖維化的靶點。