PVT1通過(guò)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特性介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞PC9厄洛替尼抵抗

湯中文 倪正義

(武漢市金銀潭醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430023)

2015年我國(guó)肺癌新發(fā)病例約73.3萬(wàn)，死亡61.0萬(wàn)，且呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)〔1〕，肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌，是肺癌主要的病理類(lèi)型，其細(xì)胞惡性程度強(qiáng)，血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期〔2〕。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是影響肺腺癌進(jìn)展的重要因素，EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞傾向于更高的惡性程度，同時(shí)存在EGFR突變的患者腫瘤進(jìn)展更快且預(yù)后不良〔3〕，表明EGFR可作為原癌基因參與促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展。厄洛替尼為表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，可顯著改善EGFR突變肺腺癌患者病情及預(yù)后水平，是目前晚期肺腺癌患者靶向治療的一線藥物之一〔4〕，然而原發(fā)及獲得性耐藥的發(fā)生將最終導(dǎo)致厄洛替尼治療的失敗〔5〕。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因(PVT)1屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)，是近年腫瘤研究的熱點(diǎn)分子，其可通過(guò)多種途徑參與促進(jìn)不同惡性腫瘤的惡性行為〔6〕。本實(shí)驗(yàn)以EGFR敏感突變的PC9肺腺癌細(xì)胞系為模型，對(duì)PVT1與厄洛替尼抵抗的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及試劑 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞包括人肺腺癌細(xì)胞系PC9(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)及人胚腎細(xì)胞293T(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))。主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：科研用鹽酸厄洛替尼(美國(guó)Selleck公司，貨號(hào)：S1023)，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(上海索寶生物科技有限公司)，嘌呤霉素(美國(guó)Sigma公司)，慢病毒包裝試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，慢病毒對(duì)照載體、干擾載體siPVT1-1及siPVT1-2(蘇州吉瑪基因股份有限公司)，TRIzol Reagent RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸熒光染料(大連寶生物工程有限公司)，qPCR引物合成(武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司)，Ripa蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蛋白酶抑制劑cocktail(美國(guó)Roche公司)，EasyBlot電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒(上海生工生物工程公司)，抗體(美國(guó)Abcam公司)：CD133(ab19898)，CD44(ab51037)，β-actin(ab8227)，Goat Anti-Rabbit免疫球蛋白(Ig)G二抗(ab6721)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：HeraguardTMECO超凈工作臺(tái)及Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)，DM1000顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，1-16K高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，2720 Thermal Cycler PCR儀及Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，iMark多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀等(上海天能科技有限公司)，Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 PC9及293T細(xì)胞均使用10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：5%CO2，37℃，濕度100%。分組處理：將293T細(xì)胞接種至6孔板中，接種濃度為2×105個(gè)/孔，共接種3孔，分別標(biāo)記為對(duì)照組、干擾A組及干擾B組病毒，培養(yǎng)過(guò)夜后取3支1.5 ml離心管，每管加入7.5 μl轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體及500 μl DMEM高糖培養(yǎng)基，并分別加入慢病毒對(duì)照載體、干擾載體siPVT1-1及siPVT1-2，充分混勻后室溫靜置20 min，分別加入相應(yīng)的293T細(xì)胞中，6 h后更換10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞上清液，過(guò)濾后得到3組病毒懸液備用。將PC9細(xì)胞接種至6孔板中，接種濃度為2×105個(gè)/孔，共接種3孔，同樣分別標(biāo)記為對(duì)照組，干擾A組及干擾B組，將各組病毒懸液與10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基1∶1混合培養(yǎng)各組PC9細(xì)胞3天，1 μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞至穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)各組細(xì)胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表達(dá)水平 收集對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞2×105個(gè)以上，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到3組細(xì)胞的cDNA模板，稀釋合成引物，引物序列：PVT1上游引物5′-CATCCGGCGCTCAGCT-3′，下游引物5′-TCATGATGGCTGTATGTGCCA-3′；CD133上游引物5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物5′-TATTCCACAAGCAGCAAA-3′；CD44上游引物5′-ACAACTGGTGATGGAGACTCATCC-3′，下游引物5′-CAGAGTGGCTTATCATCTTGG-3′；β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸熒光染料要求配置qPCR體系，行兩步法PCR擴(kuò)增：預(yù)變性95℃，30 s；擴(kuò)增反應(yīng)95℃，5 s，60℃，34 s，熔解階段95℃，15 s。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT法計(jì)算各組細(xì)胞PVT1及CD133、CD44 mRNA的表達(dá)量。

1.3.3Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞CD133和CD44 蛋白表達(dá)水平 收集對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞5×105個(gè)以上，Ripa裂解液冰上裂解細(xì)胞2 h，13 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，取50 μg配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣體系，100℃變性5 min，10%SDS-PAGE電泳穩(wěn)壓120 V，2 h，轉(zhuǎn)膜穩(wěn)流300 mA，2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS洗膜后一抗4℃搖轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，抗體濃度1∶1 000，PBS洗膜3次，1∶2 000二抗室溫孵育2 h，PBS洗膜3次后行ECL發(fā)光，Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)曝光條帶上蛋白印跡，并掃描灰度值，以β-actin為內(nèi)參基因，目的條帶與β-actin灰度值比作為目的蛋白表達(dá)量。

1.3.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞厄洛替尼半抑制濃度(IC50) 接種對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞于96孔板中，濃度2 000個(gè)/孔，設(shè)置0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L厄洛替尼濃度梯度，每組濃度梯度設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜后加入相應(yīng)濃度的厄洛替尼繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清，CCK-8試劑與10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基1∶5混合均勻后加入細(xì)胞中，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處波長(zhǎng)，以各組細(xì)胞0 nmol/L濃度的吸光值為基線繪制擬合曲線，并分析細(xì)胞厄洛替尼IC50值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表達(dá)水平的比較 對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞PVT1表達(dá)水平分別為(0.057±0.006)、(0.016±0.002)及(0.012±0.002)；對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞CD133 mRNA表達(dá)水平分別為(0.237±0.019)、(0.095±0.010)及(0.127±0.014)；對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)水平分別為(0.386±0.033)、(0.179±0.013)及(0.142±0.018)，干擾A組及干擾B組PVT1、CD133和CD44 mRNA的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞CD133及CD44蛋白表達(dá)水平的比較 對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞CD133 蛋白表達(dá)水平分別為(0.691±0.103)、(0.348±0.072)及(0.316±0.085)；對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞CD44 蛋白表達(dá)水平分別為(0.540±0.093)、(0.274±0.060)及(0.282±0.057)；干擾A組及干擾B組CD133和CD44 蛋白表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞CD133及CD44 蛋白表達(dá)水平

2.3各組細(xì)胞厄洛替尼IC50的比較 對(duì)照組、干擾A組及干擾B組細(xì)胞厄洛替尼IC50分別為〔(149.4±15.3)nmol/L〕、〔(53.1±8.2)nmol/L〕及〔(67.4±10.5)nmol/L〕，干擾A組及干擾B組厄洛替尼IC50顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

LncRNA是一類(lèi)無(wú)開(kāi)放閱讀框且轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 nt的RNA分子，其不翻譯相應(yīng)蛋白，而是通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等表觀遺傳機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)作用〔7〕。基于表觀遺傳在腫瘤中的重要地位，包括PVT1在內(nèi)的多種LncRNA被發(fā)現(xiàn)參與影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8〕，PVT1基因定位于人染色體8q24上，研究顯示其在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性行為及化療抵抗的形成：PVT1被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于胰腺癌，且表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后正相關(guān)，PVT1是導(dǎo)致胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔9〕；PVT1在胃癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與患者預(yù)后不良正相關(guān)，且在多藥耐藥的胃癌組織及細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，體外研究顯示PVT1可促進(jìn)多藥耐藥基因、mTOR信號(hào)通路及缺氧誘導(dǎo)因子1α的活化介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的惡性行為〔10〕；PVT1高表達(dá)于卵巢癌組織中，且可通過(guò)抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡介導(dǎo)其順鉑抵抗能力的形成〔11〕；PVT1還可通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)6的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖〔12〕；PVT1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，同樣可提示患者預(yù)后不良，體外siRNA介導(dǎo)PVT1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力均顯著下調(diào)〔13〕；非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)PVT1的高表達(dá)，且PVT1表達(dá)與細(xì)胞組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后顯著正相關(guān)，體外干擾PVT1表達(dá)可下調(diào)肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力，提示PVT1對(duì)肺癌細(xì)胞惡性行為存在促進(jìn)作用〔14，15〕，但目前有關(guān)PVT1與肺腺癌厄洛替尼抵抗的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制尚不明確。腫瘤干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新及多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞，其具有啟動(dòng)和重建腫瘤組織表型的能力，被認(rèn)為與惡性腫瘤放化療抵抗的形成密切相關(guān)〔16〕，CD133及CD44是經(jīng)典的非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物，CD133參與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫逃逸等機(jī)制，是影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及生存的重要分子，而CD44則參與細(xì)胞間及細(xì)胞間質(zhì)間的特異性粘連，對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化具有重要意義，兩者均被發(fā)現(xiàn)參與肺癌細(xì)胞放化療抵抗的形成〔17，18〕。另外，F(xiàn)arhana等〔19〕在研究中指出PVT1與結(jié)直腸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性存在密切聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，體外干擾PC9肺腺癌細(xì)胞系中PVT1表達(dá)后，細(xì)胞CD133及CD44的mRNA及蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示PVT1可能通過(guò)CD133及CD44轉(zhuǎn)錄水平的正調(diào)控作用，促進(jìn)肺腺癌的干細(xì)胞特性。干擾PVT1表達(dá)后，細(xì)胞厄洛替尼IC50值顯著降低，對(duì)厄洛替尼的敏感性增強(qiáng)，提示PVT1對(duì)PC9細(xì)胞厄洛替尼抵抗發(fā)生的促進(jìn)作用。綜上所述，本研究表明PVT1可通過(guò)介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性促進(jìn)其厄洛替尼抵抗的發(fā)生。