長鏈非編碼RNA MEG3通過抑制肺鱗癌干細胞特性增強平陽霉素敏感性的作用

孔樹佳 李硯文

(昆明醫科大學第三附屬醫院 云南省腫瘤醫院，云南 昆明 650118)

2015年我國新發肺癌病例73.3萬，死亡61.0萬〔1〕。肺癌組織學類型包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占全部肺癌的80%，肺鱗癌占30%，是僅次于肺腺癌的病理類型〔2〕。平陽霉素是對鱗癌有效的抗腫瘤藥物，其與博萊霉素相比，有較低的毒性和更強的藥效〔3〕，研究顯示，腫瘤干細胞在腫瘤惡性進展及放化療抵抗的形成中發揮關鍵作用〔4〕，長鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達基因(MEG)3可影響多種惡性腫瘤化療抵抗能力〔5,6〕，但其與平陽霉素抵抗形成的關系尚未有報道。本研究對平陽霉素抑制肺鱗癌細胞的能力及影響平陽霉素抵抗形成的因素進行探究。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及培養 使用人肺鱗癌細胞系H520(美國模式培養物集存庫，ATCC)，培養基：RPMI1640培養基+10%胎牛血清(FBS，美國Hyclone)，培養于CO2細胞培養箱(上海恒字)中：5% CO2，37℃，飽和濕度，1∶2細胞傳代，于超凈工作臺(美國Thermo Fisher)中嚴格無菌操作。

1.2細胞處理及分組 細胞轉染技術外源性上調H520中MEG3的表達：接種對數生長期的H520細胞于50 cm2培養瓶中，將細胞隨機分為實驗組及空白組，取2支1.5 ml離心管，加入500 μl無血清RPMI1640培養基，并分別加入4 μg 含MEG3全長序列的載體及4 μg空白載體(上海吉凱基因)，室溫靜置5 min后加入10 μl 轉染脂質體lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher)并充分混勻，室溫靜置20 min，無血清RPMI1640培養基洗細胞3次，實驗組加入含MEG3全長序列載體的混合液，空白組加入含空白載體的混合液，7 h后RPMI1640培養基+10% FBS 繼續培養48 h，得到實驗組及空白組細胞。遞增濃度梯度法建立平陽霉素(吉林敖東藥業)抵抗的H520細胞系：分別以1、2、4、8、16、32、64 μg/ml濃度誘導H520細胞，每個誘導濃度維持細胞穩定生長1 w，誘導期間每2 d更換新的平陽霉素與RPMI-1640培養基+10%FBS混合液，篩選至細胞于64 μg/ml濃度中可穩定生長，作為抵抗組，未處理的H520細胞作為對照組。

1.3熒光定量(RT-q)PCR技術檢測細胞MEG3表達 抵抗組及對照組細胞、實驗組及空白組細胞于轉染完成后48 h采用TRIzol(日本Takara)抽提總RNA，超微量分光光度計(美國Molecular Devices)檢測RNA濃度，逆轉錄試劑盒(日本Takara)對1 μg RNA行逆轉錄，得到相應的cDNA模板，無核酶水(美國Thermo Fisher)稀釋至100 nmol/(L·ml)，每個上樣孔按10 μmol/L上游引物及下游引物(由上海生工生物工程公司合成)、5 μl cDNA模板及10 μl SYBR Green熒光染料體系進行上樣，引物序列：MEG3：正義鏈5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反義鏈5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：正義鏈5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反義鏈5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。7500實時熒光定量PCR系統(美國Applied Biosystems)檢測MEG3及GAPDH熒光強度，以GAPDH為內參基因，2-△△CT法計算MEG3的表達量。

1.4Western印跡法檢測細胞八聚體結合轉錄因子(Oct)-4及性別決定區Y框蛋白(Sox)-2表達水平 收集50 cm2培養瓶中的各組細胞，細胞數>1×106個，RIPA裂解液(上海生工生物工程公司)重懸細胞，冰上裂解細胞2 h，離心機(德國Eppendorf 5417r)，4℃，離心10 min，取細胞上清液，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海生工生物工程公司)檢測總蛋白濃度，30 μg行10%聚丙烯凝膠電泳，100 V電壓轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore)，脫脂牛奶封閉1 h，1∶1 000 Oct-4(美國Abcam，ab18976)孵育45 KDa條帶，1∶1 000 Sox-2(美國Abcam，ab92494)孵育34 KDa條帶，1∶1 000 GAPDH(美國Abcam，ab181603)孵育37 KDa條帶，室溫孵育3 h，1∶2 000羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美國Abcam，ab6721)孵育各條帶1 h，電化學發光(ECL)底物(美國Thermo Pierce)孵育條帶1 min，ChemiDoc XRS+化學發光成像系統(美國Bio-Rad)曝光顯影，以相對灰度值表示蛋白表達水平。

1.5細胞計數試劑盒(CCK-8)實驗檢測細胞平陽霉素半抑制濃度(IC50) 將各組細胞接種至96孔板，濃度2×103個/孔，設置0、5、10、20、40、80 μg/ml濃度梯度，每組設置5個平行樣本，12 h后以含相應濃度平陽霉素的RPMI-1640培養基+10%FBS混合液替換原有培養基，處理24 h后，CCK-8試劑(日本同仁化學)與RPMI-1640培養基+10%FBS 1∶8混合液替換含平陽霉素的培養基，生化培養箱中孵育1 h，酶標儀(美國Molecular Devices)檢測各樣本450 nm處吸光度(OD)值，OD值表示細胞活力。

1.6統計學方法 SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗、回歸分析。

2 結 果

2.1各組細胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達水平比較 實驗組MEG3表達水平顯著高于空白組，差異具有統計學意義(t=5.837，P<0.01)；抵抗組MEG3表達水平顯著低于對照組，差異具有統計學意義(t=4.513，P<0.01)。實驗組Oct-4表達水平顯著低于空白組，差異具有統計學意義(t=2.597，P<0.05)；抵抗組Oct-4表達水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義(t=2.846，P<0.05)。實驗組Sox-2表達水平顯著低于空白組，差異具有統計學意義(t=3.892，P<0.01)；抵抗組Sox-2表達水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義(t=4.604，P<0.01)，見表1。

表1 各組細胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達水平比較

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2各組細胞平陽霉素IC50的比較 實驗組平陽霉素IC50顯著低于空白組〔(8.21±1.48)μg/ml vs (13.39±2.02)μg/ml〕，差異具有統計學意義(t=2.994，P<0.01)，見圖1；抵抗組平陽霉素IC50顯著高于對照組〔(32.50±7.26)μg/ml vs (12.67±3.61)μg/ml〕，差異具有統計學意義(t=8.238，P<0.001)，見圖2。

圖1 實驗組與空白組平陽霉素IC50值的比較

圖2 抵抗組與對照組平陽霉素IC50值的比較

3 討 論

平陽霉素對多數鱗癌細胞均具有較佳的療效，目前作為口腔鱗癌及舌鱗癌的一線用藥廣泛應用〔7,8〕，但其對于肺鱗癌的療效鮮有報道。LncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，其不編碼蛋白，直接通過表觀遺傳、轉錄及轉錄后修飾等機制發揮生物學作用〔9〕，MEG3作為其中的一員被發現與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，其可抑制胃癌、前列腺癌、膀胱癌及NSCLC等多種惡性腫瘤細胞〔10～13〕，且影響腫瘤細胞化療抵抗的形成：Li等〔5〕研究顯示，MEG3可通過促進細胞凋亡顯著提高結直腸癌細胞奧沙利鉑的敏感性；Liu等〔6〕研究發現，MEG3在順鉑抵抗的NSCLC組織及細胞中表達下調，在順鉑抵抗的NSCLC細胞中外源性上調MEG3后，細胞順鉑敏感性恢復，表明MEG3對NSCLC順鉑敏感性存在促進作用；Zhou等〔14〕研究顯示，MEG3在伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病患者中表達顯著下降，伊馬替尼抵抗的K562細胞中表達同樣顯著降低，過表達MEG3后，伊馬替尼抵抗的K562細胞增殖能力顯著下降，細胞凋亡增加，且伊馬替尼敏感性增強；同時MEG3還可促進腦膠質瘤細胞及卵巢癌細胞對順鉑的敏感性〔15,16〕。本實驗結果顯示，平陽霉素可有效抑制肺鱗癌的細胞活力，是有效的抗肺鱗癌藥物，在野生型肺鱗癌細胞H520中外源性上調MEG3可顯著增強H520細胞平陽霉素的敏感性，且H520平陽霉素抵抗細胞株MEG3的表達出現顯著下調，提示MEG3對肺鱗癌細胞平陽霉素敏感性存在重要促進作用。腫瘤干細胞是控制腫瘤惡性行為的關鍵因素，包括腫瘤細胞的無限增殖、侵襲轉移及放化療抵抗，Oct-4及Sox-2是干細胞特征性標志物，兩者相互作用，共同維持腫瘤的干細胞特性〔17〕。Balci等〔18〕研究指出MEG3在腦腫瘤干細胞中表達顯著下調，由此推測MEG3可能影響肺鱗癌干細胞特性，進而調控其對平陽霉素的敏感性，本研究顯示，上調MEG3后H520細胞Oct-4及Sox-2均顯著下調，在平陽霉素抵抗細胞系中Oct-4及Sox-2顯著上調，提示腫瘤干細胞與平陽霉素抵抗的形成密切相關，且MEG3可通過抑制肺鱗癌干細胞特性，增強其對平陽霉素的敏感性。