骨關節炎模型大鼠血清骨保護素及軟骨下骨降鈣素基因相關肽、神經生長因子表達及Mankin評分變化

常琦 阮貞 王憲偉 王茂朋

(1三峽大學附屬仁和醫院急診科，湖北 宜昌 443001；2宜昌市中心醫院心內科；3三峽大學附屬仁和醫院骨科)

前列腺素和甲狀旁腺激素可刺激骨關節炎(OA)軟骨下骨的成骨細胞合成環磷酸腺苷的能力下降，而其均在OA中發揮相應作用，說明成骨細胞功能缺陷與OA軟骨下骨重塑相關〔1〕。研究表明，一系列相關因子對成骨細胞及破骨細胞活性均有調節作用，已經明確骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)在調節軟骨下骨的重塑中起著重要的作用〔2〕。交感系統調控著骨代謝，目前已比較明確的在骨組織中發揮重要調節作用的物質有降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)、神經肽(NP)Y等，這些神經因子在骨的生長發育等過程中起著重要的作用，CGRP、神經生長因子(NGF)能促進成骨細胞成熟，加速骨折愈合，另外研究也顯示這些神經因子參與股骨頭壞死疾病的進展〔3，4〕。本實驗觀察OA大鼠造模后不同時期軟骨下骨CGRP、NGF的改變，并測定其相應時期血清OPG濃度的改變，以更好地了解OA軟骨下骨骨代謝調節機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑 SPF 級雄性 SD 大鼠(購自三峽大學實驗動物中心) 40 只，5月齡，體重 260～290 g，飼養于三峽大學動物實驗中心，飼養環境達到動物實驗條件要求。隨機分為4組，分別為對照組，實驗組(2 w組，4 w組，8 w組)，每組10只，對照組為假手術，2 w組、4 w組和8 w組為造模2、4、8 w后處死組。OPG酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和NGF 兔抗鼠單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；CGRP 兔抗鼠單克隆抗體 (北京博奧森生物技術有限公司)；生物素化羊抗兔二抗試劑盒(天津 TBD 生物工程有限公司)；青霉素粉劑(華北制藥股份有限公司)；其他實驗常用試劑均為國產分析純。

1.2大鼠OA模型的制備 采用大鼠前交叉韌帶切斷方法造模，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，麻醉完成后，備皮，常規右后膝消毒鋪巾后，行膝髕旁內側切口，切開皮膚，仔細分離皮下組織，將髕骨向外側脫位，切開關節囊，顯露膝關節，屈曲膝關節，可見膝關節前交叉韌帶，以剪刀剪斷，行前抽屜實驗(+)，證明實驗切斷前交叉成功，生理鹽水反復沖洗傷口，以4-0愛惜康帶針線縫合關節囊及皮膚，活力碘消毒，術后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。對照組造模方法同前，顯露膝關節，屈曲見膝關節前交叉韌帶連續性完整，前交叉實驗，生理鹽水反復沖洗膝關節，以4-0愛惜康帶針線縫合關節囊及皮膚，術后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。

1.3大鼠血清OPG測定 腹腔麻醉完成后，胸部剪毛備皮，常規活力碘消毒，鋪無菌巾，沿胸骨左緣切開皮膚，剪斷肋骨，顯露心臟，用靜脈采血針插入左心室，抽取約3 ml血液，放入低溫(4℃)冰箱靜置，30 min后離心機離心(3 000 r/min)，再放入-80℃冰箱保存，待所有血清標本收集后，常溫下復融，按照OPG ELISA試劑盒說明書進行操作，經酶標儀在450 nm光度值下測定其OD值，繪出標準線性方程，根據相應結果測出OPG濃度。

1.4大鼠軟骨下骨CGRP、NGF免疫組化切片制作 大鼠心臟取血完成后，立即沿右后膝原來手術切口切開皮膚，分離皮下筋膜組織，髕骨外翻，切開關節囊，顯露膝關節，肉眼觀察膝關節軟骨退變大體情況，取脛骨內側髁，完整剔除周圍肌肉筋膜等軟組織，置于4%多聚甲醛溶液下，4℃冰箱固定24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分浸洗，沖洗2 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4 w，修整組織塊，石蠟包埋處理，作冠狀面不連續切片，每個標本切9張，間隔100 μm切片，各取3張分別行HE，NGF和CGRP免疫組化染色。肉眼觀察大鼠膝關節大體情況，顯微鏡下觀察HE染色，并對軟骨進行Mankin評分，采用ImageProPlus5.0.2圖像分析系統軟件分析CGRP、SP免疫組化染色切片，置于40倍物鏡下取軟骨表層至鈣化層為觀察范圍，每個標本隨機選3個視野，測定其灰度值。

1.5統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1實驗動物一般情況 動物術后均未發生傷口感染，早期大鼠活動減少，跛行，1 w后基本恢復正常活動，未發生死亡情況。

2.2HE染色細胞形態學 對照組關節軟骨的層次結構清晰，軟骨表面無破壞，保持其完整性；2 w組關節軟骨表層軟骨細胞發生改變，可見細胞聚集現象，于軟骨表層及中間層交界處，可見不規則軟骨細胞，軟骨細胞呈巢狀，排列紊亂，軟骨細胞大小、密度不均一；4 w組軟骨細胞數量變少，排列更加紊亂，可見軟骨表明毛糙；8 w組上述改變更加嚴重，部分區域軟骨細胞缺損(圖1)。2 w組〔(3.82±0.48)分〕，4 w組〔(5.24±0.92)分〕，8 w組Mankin評分〔(7.14±0.31)分〕明顯高于對照組〔(0.58±0.53)分〕，表明建模成功，各組間比較有統計學差異(F=25.3，P<0.01)。

圖1 各組軟骨細胞HE染色(×40)

2.3血清 OPG 結果 與對照組(290.7±10.4)相比，2 w組(263.6±8.2)及4 w組血清OPG濃度(178.5±7.5)逐漸下降，8 w組(240.9±6.3)又稍回升，各組間比較有統計學差異(F=29.3，P<0.01)。

2.4CGRP、NGF免疫組化染色切片結果 CGRP、NGF免疫組化染色，兩組變化趨勢相一致，對照組骨小梁區周圍著色區域多，著色較深；2 w組骨小梁著色區域變淡；4 w組相應著色更少，8 w組較前顏色稍加深，見圖2、圖3?；叶戎到Y果見表1，CGRP各組間比較存在統計學差異(P<0.01)，NGF各組間比較存在統計學差異(P<0.01)。

圖2 各組CGRP免疫組化切片(×100)

圖3 各組NGF免疫組化切片(×100)

組別CGRPNGF對照組190.2±8.3110.6±4.52 w組171.2±6.892.6±5.14 w組113.5±8.663.0±7.38 w組145.7±6.977.2±4.8F/P值22.8/<0.0125.8/<0.01

3 討 論

OA是最常見的一種關節疾病，其發生是由于各種因素導致生物力學特性改變，致使關節軟骨、軟骨下骨及細胞外基質失衡。長期以來，軟骨退變一直是國內外比較關注的重點，對于軟骨下骨的作用研究較少，近些年來發現軟骨下骨改變是OA的重要病理變化，盡管對于其是否是OA始發因素尚存在爭論。許多基礎實驗證明，OA時軟骨下骨重塑所導致的骨質硬化，骨密度增高，使軟骨下骨的生物學性能改變，其對關節軟骨的保護功能下降，進而引起或者加重關節軟骨退變〔5〕。

OPG、RANKL、RANK是目前公認的調控骨代謝的重要途徑，其為腫瘤壞死因子家族成員，通過作用于破骨細胞，調控著骨形成及骨吸收。RANK與RANKL結合后，可通過核因子途徑激活破骨細胞分化的信號傳導通路，誘發相應激酶，發生一系列酶鏈反應，激活核因子復合體、活化蛋白-1及轉錄因子，核因子再次激活破骨細胞前體細胞的核因子復合體，通過一系列反應，使沒有功能的破骨細胞轉化成有活性的破骨細胞。最近研究發現，OPG/RANK/RANKL不僅在軟骨下骨中表達，發揮調節作用，軟骨本身也能產生OPG、RANK、RANKL，OPG通過相應途徑調控軟骨代謝，在OA疾病進展中發揮著不可忽略的作用〔6〕。研究發現〔7〕，通過實時定量PCR進行分析發現，OA組和正常組均有上述因子產生，軟骨細胞OPG的含量較RANK與RANKL高，OA患者RANK含量明顯較正常組增高。OA軟骨產生并分泌OPG，在OA軟骨細胞表面，也可以發現RANK及RANKL，有趣的是，盡管膜性RANKL在所有軟骨細胞均可發現，膜性RANK僅在軟骨細胞某些亞群產生，僅有(29±4)%的軟骨細胞產生RANK，這些軟骨細胞分布在整個軟骨層，進一步深入研究發現，表達RANK的軟骨細胞其軟骨細胞標志物如蛋白聚糖，膠原酶-Ⅱ含量明顯增高。本實驗通過測量血清OPG含量，從側面間接反映大鼠OA時期軟骨代謝的改變，發現早期OPG含量一直下降，8 w后又稍上升，這些與上述結果符合，也與文獻報道的其他實驗結果類似〔8〕，這些均說明OPG在OA疾病進展中發揮著不可忽略的作用。OA早期，骨吸收為主要改變，OPG的抑制破骨細胞功能下降，破骨細胞功能加強，導致軟骨下骨皮質終板及骨小梁稀疏變薄，最終骨小梁失去彈性；后期，OPG含量逐漸增高，促進成骨細胞功能加強，關節形成骨贅，代償關節改變。提示OA軟骨下骨骨代謝不單純是骨吸收過程，其是骨吸收與骨形成共同作用，軟骨下骨較高的骨轉化率是其重要的特點。

正常骨組織代謝離不開神經系統有效的調控，骨組織中含有較多的神經分泌的NP類物質，如CGRP、SP、VIP、NPY等，這些物質的受體均在骨組織中表達，許多在體實驗研究發現，這些肽類物質調控著骨的代謝，影響骨細胞的生物學功能〔8〕。交感神經、感覺神經在骨小梁附近血管周圍交織成稠密的網織結構。實驗及臨床研究發現神經系統在骨的形成、生長、轉化及修復過程中具有很關鍵的作用〔9〕，這些神經元細胞在外周的生長與生存又需要外周信號的引導，在骨組織中承擔這一角色的是NGF，總而言之，正常骨代謝需要交感神經系統、感覺神經系統及骨組織內相應細胞的共同作用。本實驗結果說明在早期軟骨下骨骨吸收為主，而CGRP對骨組織主要的生理學作用為促進成骨細胞成骨作用，其通過促進成骨細胞環腺苷酸(c-AMP)形成，提高成骨活性，并刺激成骨細胞來源細胞增殖、分化。更深入研究〔10〕發現CGRP可增加胰島素樣生長因子(IGF)-1 mRNA的表達，使IGF-1合成增加，從而促進骨形成。CGRP尚具有抑制破骨細胞的功能，使骨吸收能力下降，降低血中鈣含量。骨折時，CGRP含量明顯上升，促進骨形成，抑制骨吸收，促進骨折的愈合。體外研究發現〔11〕，CGRP可抑制骨髓間充質干細胞向破骨細胞轉化，促進成骨細胞增殖，進而抑制骨吸收，促進骨形成。有研究表明〔12〕，CGRP還可通過促進血管內皮細胞增生來促進骨的血管化，而血管化又與軟骨下骨骨髓組織纖維化及OA疼痛相關。軟骨下骨骨髓組織纖維化與NGF的關系也很密切，其能誘使神經纖維長入骨組織中，加重OA疼痛癥狀。NGF能誘使血管及神經組織生成，有研究發現NGF受體可在成骨細胞上表達，NGF與之結合后，增強其成骨能力〔13〕。近期研究顯示，NGF在介導OA滑膜血管生成及疼痛方面有重要作用〔14〕，神經因子，特別是NGF在OA關節滑液及滑膜炎患者滑膜組織中表達，另一實驗證明人類軟骨細胞能合成NGF并在其表面表達高親和性NGF受體，在OA病程中，軟骨細胞NGF及其受體表達上調，表明NGF在OA病程中能促進軟骨細胞代謝〔15〕。

綜上，軟骨下骨在OA中的作用是當前研究的熱點，通過藥物作用于軟骨下骨，改善其代謝，維持其生物力學特性，或許是OA藥物治療的一個新的方向。采用前交叉韌帶切斷方法可成功制造大鼠OA模型，該實驗方法簡單，成功率高；血清OPG、軟骨下骨CGRP、NGF作為調節骨代謝因子，調控著OA軟骨下骨骨代謝，是OA疾病發生的重要因子；通過藥物調節軟骨下骨骨代謝有希望達到治療OA的目的。