功能驗證P62基因在胰腺癌轉移過程中的作用

田文嘉 林香春

(北京大學國際醫院，北京 102206)

胰腺癌是消化道系統預后最差的惡性腫瘤之一，在癌癥相關死亡中位列第四〔1〕，而轉移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔2〕。胰腺癌的發生、發展和轉移是一個多基因、多信號通路參與的復雜的生物過程〔3〕。因此，發現和驗證與胰腺癌轉移有因果關系的基因及其分子機制對胰腺癌的診斷和治療有重要意義。本實驗在結合前期全基因組基因突變技術篩選得到的P62基因的基礎上，利用小干擾RNA(siRNA)、Werstern印跡、細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)等方法，進一步探討P62基因在胰腺癌轉移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人胰腺癌AsPC-1來自北京協和醫學院基礎醫學研究所。胎牛血清(FBS)購自美國NQBB公司，DMEM培養基購自美國HyClone公司，LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司，抗P62單克隆抗體購自Cell Signalling公司。

1.2細胞培養 AsPC-1細胞培養采用DMEM高糖培養基，加入10% FBS，將AsPC-1細胞放于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中，待細胞生長至對數生長期。

1.3總RNA的提取和熒光定量PCR 用TRIzol法提取細胞總RNA，用反轉錄試劑合成cDNA。以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒檢測P62 mRNA的表達情況。熒光定量PCR引物由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成，P62上游引物序列為5′-CUUGCGUAGAAUUGCAGGUTT-3′，下游引物序列為5′-ACCUGCAAUUCUACGCAAGTT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物序列為5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游引物序列為5′-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3′。熒光定量PCR條件：95℃ 10 min；94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 10 s，40個循環。實驗重復3次。

1.4蛋白質印跡法 細胞用放射免疫沉淀法裂解液(RIPA)裂解提取蛋白質后用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白質濃度，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白質后轉移至硝酸纖維素膜，然后用兔抗人P62(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育1 h。蛋白質表達水平用電化學發光顯色試劑盒檢測。

1.5細胞轉染 實驗分為陰性對照(NC)組和P62 siRNA干擾(si-P62)組，將培養至對數生長期的AsPC-1種植于6孔板中，待細胞密度生長至70%左右時，按照說明書的操作，分別將等量的NC及P62特異性siRNA轉染至兩組細胞中,細胞培養4 h后，換液繼續培養細胞。

1.6CCK-8實驗 將培養至對數生長期的AsPC-1細胞清洗、消化，制備成細胞懸液，根據每孔2 000個細胞的鋪板細胞數，將細胞懸液接種到96孔板上，每孔200 μl，每個樣本重復6次。分別將等量的NC及P62特異性siRNA轉染至兩組細胞中，細胞培養4 h后，換液繼續培養細胞。在每天同一時間向每孔中加入20 μl CCK-8溶液，在37℃孵箱中孵育3 h，用于檢測轉染siRNA后的胰腺癌細胞的增殖情況。用酶標儀測定不同時間點(12、24、36、48 h)兩組細胞在450nm波長處的光吸收值(A值)，以反映細胞的增殖情況。

1.7統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組P62 mRNA表達情況比較 si-P62組(0.036±0.05)P62 mRNA表達水平明顯低于NC組(1.000±0.90,P<0.01)。見圖1。

圖1 兩組P62蛋白表達結果

2.2P62表達對胰腺癌細胞增殖能力的影響 與NC組相比，si-P62組細胞24、36、48 h細胞A值均顯著下降(P<0.01，P<0.001)。見表1。

表1 兩組12、24、36、48 h細胞增殖能力比較

3 討 論

近年來，胰腺癌患者的治療仍然是早期根治性手術切除加術后放療、化療，而胰腺癌起病隱匿，早期沒有特異性的臨床癥狀和體征，發現時多已處于中、晚期階段，超過80%的患者由于腫瘤的遠處轉移而沒有機會獲得治愈性的手術切除〔4〕，所以胰腺癌的死亡率依然沒有明顯改善。

自噬的概念是由Ashford等〔5〕在1962年研究肝細胞糖代謝時發現細胞內有“自己吃自己”的現象后提出來的。在正常情況下，自噬能夠通過對胞內物質的降解，從而實現自身細胞器的更新。然而，研究發現自噬是一把雙刃劍，它在正常細胞中扮演抑制細胞癌變的角色，但在已經發生癌變的細胞中，自噬卻能夠通過賦予腫瘤細胞抵抗外界不良環境的能力，進而促進腫瘤細胞的增殖和轉移〔6〕。研究已經揭示哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、大鼠肉瘤(RAS)-環磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路在自噬中起重要的作用〔7〕，但是，對于自噬在腫瘤細胞中具體的分子機制仍不清楚。

本研究選用分化好、惡性程度相對低的AsPC-1人胰腺癌細胞系作為研究對象，在前期采用全基因組隨機基因敲除技術平臺，篩選得到的能夠將低轉移性AsPC-1細胞轉變為高轉移細胞的P62基因的基礎上〔8〕，進一步功能驗證P62基因在胰腺癌轉移過程中的作用，為進一步探討P62影響胰腺癌轉移能力的分子機制提供了理論基礎。