長期負性情緒應激對大鼠學習記憶及海馬Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB信號通路的影響

詹向紅 呂茹 王慧霞 劉永 李偉 劉勝利

(河南中醫藥大學認知神經科學實驗室，河南 鄭州 450046)

隨著生活方式的轉變，人們承受的各種精神壓力和情緒刺激不斷增加，若情緒調節不良，可嚴重影響人類的身心健康，加速機體正常衰老進程，并引發學習記憶障礙、癡呆、抑郁癥、免疫力低下等多系統疾患〔1〕，目前關于認知功能衰退的確切機制尚不清楚。有研究發現，慢性應激性抑郁會引起海馬神經元谷氨酸(glu)含量升高，N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)過度激活〔2〕，細胞膜對鈣離子(Ca2+)通透性增加，大量Ca2+內流導致細胞內鈣超載。而鈣在神經生長及突觸重塑方面有非常重要的作用〔3〕，它通過與特異性的鈣調蛋白(CaM)結合，進一步激活下游信號通路〔如環腺苷酸反應元件結合蛋白(CREB)〕，調控與認知相關的基因轉錄〔4〕，影響大腦的學習記憶能力，因此認為Ca2+濃度的改變在阿爾茨海默病(AD)和血管性癡呆(VD)中起關鍵作用〔5，6〕。可見，慢性負性情緒應激可以使神經細胞內鈣代謝失衡，進而影響認知功能。本課題組前期研究證實長期單一負性情緒應激是老年性癡呆發病的危險因素〔7〕，但在日常生活中，人們更多處于多種負性情緒的復合應激狀態，其對認知衰退進程的影響及其機制尚不清楚。因此，本實驗擬觀察長期負性情緒應激對大鼠學習記憶能力的影響，并從鈣信號通道探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級3月齡Wistar大鼠56只，購于山東魯抗公司(SCXK〔魯〕2013-0001)，雌雄各28只，雄鼠體重(360±10)g，雌鼠體重(300±10)g。實驗在河南省中醫藥研究院動物實驗中心IVC環境動物實驗室(SYXK〔豫〕2012-0009)進行，并經河南中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2分組及造模

1.2.1分組 Wistar大鼠正常飼養1 w后，按體重剔除2只偏大的個體，剩余54只大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、D-半乳糖(gal)腦老化陽性對照組(以下簡稱D-gal腦老化組)、長期負性情緒應激組(以下簡稱負性情緒應激組)，每組14只，雌雄各半，其余12只作為攻擊鼠。各組雌雄大鼠分籠飼養，自由飲食飲水。

1.2.2動物處理 D-gal腦老化組：參考李文彬〔8〕的方法，于大鼠頸背部皮下多位點注射D-gal 0.1 g/(kg·d)，連續6 w，復制D-gal腦老化大鼠模型，作為陽性對照。空白對照組：于同樣部位注射等容積的生理鹽水，1次/d，連續6 w。負性情緒應激組：采用本課題組優化和改良的不可預知性刺激誘發長期負性情緒應激〔9，10〕。自實驗第15天開始，負性情緒應激組大鼠分別依次接受8種不同的刺激(束縛、溫水游泳、間接電擊、搖晃、強光、潮濕墊料、噪聲、懲罰性飲水)，每天1種，隨機出現，持續4 w。

1.3認知功能檢測 參照李文彬〔8〕實驗方法，實驗第37天開始進行為期6 d的空間學習記憶能力測試，記錄大鼠尋找水下平臺的潛伏期，即尋臺時間(SPL)，以此作為定位學習記憶成績；在相同的條件下，尋臺時間越長說明學習記憶能力越差。

1.4海馬CA1區錐體細胞Ca2+/CaM通路的檢測 ①采用高效液相法測定glu濃度：取凍存的腦勻漿樣品溶液12 μl，于進樣瓶中加入衍生試劑6 μl，四硼酸鈉緩沖液(pH9.18)480 μl，混勻，20℃靜置3 min后進樣和檢測。 ②采用熒光免疫染色法檢測細胞內Ca2+濃度：磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌待測樣本，Rhod2-AM探針終濃度為4 μmol/L，37℃孵育20 min；PBS洗滌3次，充分去除未進入細胞內的探針；用高內涵成像系統檢測細胞內Ca2+含量。③采用Western印跡方法測定NMDAR、CaM和P-CREB的含量：按試劑盒說明進行規范操作。應用Gel-Pro3軟件對結果進行灰度分析，以GAPDH為內參照，計算NMDAR、CaM、P-CREB/GAPDH光密度比值，反映NMDAR、CaM、P-CREB相對含量變化。

1.5統計方法 采用SPSS22.0軟件，三組實驗數據進行方差分析，各組間兩兩比較用LSD-t法。

2 結 果

2.1一般情況觀察 空白對照組大鼠皮毛光澤度好，反應靈敏，活動自如，精神狀態良好；D-gal腦老化組和負性情緒應激組大鼠一般情況大致類似，均呈現毛發雜亂、無光澤，精神倦怠，反應遲鈍，活動減少等情況。

2.2長期負性情緒應激對大鼠認知功能的影響 與空白對照組〔(22.10±11.22)s〕相比，D-gal腦老化組〔(30.08±7.60)s〕和負性情緒應激組〔(30.13±10.43)s〕SPL均明顯延長(P<0.05)；D-gal腦老化組與負性情緒應激組的SPL無明顯差異，均耗費較長時間尋找跳水平臺。

2.3長期負性情緒應激對CaM通路的影響

2.3.1長期負性情緒應激對海馬神經元內glu和Ca2+濃度的影響 與空白對照組相比，D-gal腦老化組和負性情緒應激組海馬神經元glu含量和Ca2+濃度均顯著增加(P<0.05)；D-gal腦老化組與負性情緒應激組海馬神經元glu含量和Ca2+濃度比較無明顯變化。見表1。

2.3.2長期負性情緒應激對海馬神經元NMDAR、CaM、P-CREB的影響 與空白對照組相比，D-gal腦老化組和負性情緒應激組海馬神經元NMDAR含量均顯著增加(P<0.05)，CaM和P-CREB含量均顯著下降(P<0.05)；與D-gal腦老化組相比，負性情緒應激組海馬神經元內CaM含量明顯升高(P<0.05)，NMDAR和P-CREB含量無顯著差異，見表2。

表1 各組海馬神經元內glu和Ca2+濃度的比較

與空白對照組比較：1)P<0.05

表2 各組海馬NMDAR、CaM、CREB含量比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與D-gal腦老化組比較：2)P<0.05

3 討 論

D-gal注射方法制備腦老化模型，主要機制是氧化應激產生大量自由基，進而鈣穩態失調造成線粒體不可逆損傷、神經退行性變，最終表現為認知功能下降〔11，12〕，此法被公認能較好模擬自然衰老與腦老化狀態。因此，本實驗選擇D-gal注射方法制備腦老化大鼠模型，并作為陽性對照。實驗結果顯示，負性情緒應激組大鼠與D-gal腦老化大鼠一樣，均呈現擬衰老及腦老化效應，與課題組前期研究結果一致，即慢性負性情緒應激可降低大鼠的興奮性、探究趨勢及認知功能〔13〕。

海馬是情緒、學習與記憶、免疫等的調節中樞〔14，15〕，海馬神經元的興奮性傳遞主要由glu受體介導，glu能系統異常與癡呆發病的關系尤為密切。NMDAR是glu受體亞型之一，在海馬及大腦皮層分布密集，可調節學習記憶突觸的可塑性〔16〕。長期負性情緒應激可刺激海馬，使突觸前glu大量釋放，激活NMDAR，促使細胞內Ca2+濃度升高，引起興奮毒性的產生。Ca2+濃度的升降對調節細胞活動起著決定性作用，在生理濃度范圍內，Ca2+濃度升高可通過激活Ca2+-CaM-鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ-CREB信號轉導通路促進學習記憶的形成，Ca2+結合CaM后激活CaMKⅡ，有活性的CaMKⅡ在學習記憶過程中發揮重要的作用，通過P-CREB蛋白KID區的Ser133，使啟動子序列上的CRE元件乙酰化，同時啟動基因轉錄〔17〕；CREB介導的基因轉錄影響腦源性神經生長因子(BDNF)的表達，而BDNF在腦的發育、分化和突觸重塑等方面發揮重要作用。因此，Ca2+-CaM-CREB信號通路直接參與調控大腦學習記憶能力。

本研究發現，負性情緒應激組大鼠海馬神經元glu、NMDAR含量和Ca2+濃度均顯著升高，CaM和P-CREB含量均顯著下降。前三個指標升高，推測可能是由于長期負性情緒應激引起了大鼠海馬神經元突觸釋放大量的glu，與之結合的NMDAR增加，引起神經元在興奮過程中大量Ca2+流入，Ca2+濃度過高會產生細胞毒性。然而，現代研究已證實〔18〕，細胞存在自我保護機制，為抑制神經元內Ca2+濃度過高，CaM可能更多地與鈣通道的Cavl.2的c末端結合，使游離CaM含量下降，同時兩者結合使鈣通道失活〔19〕，這就導致CaM與Ca2+結合量減少，激活CaMKⅡ的能力減弱，使得P-CREB含量下降，其調節轉錄的能力失控，學習記憶相關蛋白合成障礙，表現為大鼠學習記憶能力下降，這也正是負性情緒應激大鼠SPL延長的原因所在。雖然負性情緒應激組和D-gal腦老化組大鼠海馬神經元CaM含量較空白對照組下降，但負性情緒應激組CaM含量下降程度不及D-gal腦老化組。可見，兩者海馬神經元的損傷程度不完全一致，其具體原因還需進一步研究。

綜上，長期負性情緒應激是加速認知衰退進程的重要原因之一，其部分機制是通過Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB信號通路影響與學習記憶相關蛋白的表達，從而導致學習記憶能力下降。