廣西壯族絕經后婦女雌激素受體-α基因多態性對堿性磷酸酶和骨密度的影響

顧建忠 李海 陳建海 楊潔 方曉燕 黎飚 潘春玲

(右江民族醫學院1研究生院，廣西 百色 533000；2基礎醫學院)

社會老年化是全球性難題，近年來中國老年化逐年加快，伴隨是老年性疾病日益嚴重，絕經后骨質疏松(PMOP)也稱為Ⅰ型骨質疏松，其發病率最高且臨床癥狀最重。絕經婦女，卵巢功能下降，雌激素分泌減少，引起雌激素減少所致的骨質流失，引起PMOP〔1，2〕。但臨床上也發現同是絕經婦女在同樣的雌激素水平的情況下，也有不出現骨質疏松的情況。這可能是雌激素受體(ER)的問題〔3，4〕，不同ER基因型是否會影響到雌激素功能的發揮，這與遺傳因素有關。本文探討ER-α基因多態性及不同基因型與骨代謝密切相關的堿性磷酸酶(ALP)和骨密度(BMD)的相關性，尋找PMOP的絕經婦女ER-α基因的易感基因，做好提前防治，減輕這種疾病所致社會和家庭負擔。

1 對象和方法

1.1研究對象 廣西壯族絕經婦女(祖宗三代為純廣西壯族)，并剔除心肝腎等器官疾病且無骨方面疾病。半年內無服用激素之類對骨代謝有影響的藥物。612例廣西壯族絕經婦女(40～80歲)。

1.2BMD的檢測 使用德國制造骨密度儀(Quantitative Ultrasound Bone Densitometry，QUS)測量受試者右側跟骨的骨密度(BMD)，超聲跟骨BMD儀是目前應用范圍最廣、受試對象最容易接受無損害設備。由同一特訓、熟練的BMD度儀操作人員測定。 生化試劑盒法測定血清ALP水平。

1.3ER基因多態性檢測

1.3.1引物設計與合成 引物設計參考有關文獻進行〔3〕，上游引物：5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′，下游引物：5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′。擴增樣本的ER基因第1內含子及第2外顯子，產物為1.3 kb片段。

1.3.2提取DNA模板 用碘化鈉法。取100 μl抗凝全血加入雙蒸水無菌100 μl，并搖混勻，加NaI (6 mol/L)200 μl震蕩30 s，再加等體異戊醇/氯仿(1∶24)震蕩30 s，離心分離上清液，在上清液里加異丙醇混(1∶0.6)渦旋混勻，4℃放置15 min，離心并取沉淀物，再用70%乙醇洗滌沉淀物1次，晾干沉淀物并溶于Tris-Hcl+EDTA溶液中，DNA提取物用紫外分光光度計定量，放置-20℃低溫冰箱待測。

1.3.3PCR擴增 內含10倍緩沖液200 μmol/L和dNTPs200 μmol/L的反應體系為50 μl，0.4 μmol/L的引物，0.1 μg的模板DNA。把反應體、引物和DNA模板一起置于日本產熱循環儀(Bio-Rad型)中，經95℃預變性5 min后加入3 U 的TaqDNA聚合酶。反復32次循環，再94℃變性30 s，61℃退火60 s，再在72℃條件下延伸90 s，最后一次循環后，再經72℃10 min最后延伸。取其10 μl產物經凝膠電泳儀進行電泳，染色(用溴乙啶)后，在紫外燈下檢測結果和特異性。

1.3.4酶切擴增物 取限切酶PvuⅡ10 U，限切酶XbaⅠ20 U和擴增產物10 μl共置于37℃酶切3 h。反應最終產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色30 min，DNA分子量Marker為參考，電泳結果在紫外燈下觀察。

1.4統計學處理 應用SSPS18.0軟件進行方差分析、t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1ER-α 基因型分析 使用PvuⅡ酶切可區分出3種基因型：PP 型(1.3 kb大小的1條帶)；Pp型(1.3 kb，860 bp，460 bp 大小的3條帶)，pp型(860 bp，550 bp；460 bp大小的3條帶)，見圖1。使用XbaⅠ進行酶切可以區分出3個基因型：XX型(1.3 kb大小的1條帶)，Xx 型(1.3 kb，900 bp，380 bp大小3條帶)，xx 型(900 bp，650，380 bp大小3條帶)，見圖2。

圖1 ER-α基因PvuⅡ多態性電泳圖

圖2 ER-α基因XbaⅠ多態性電泳圖

2.2ER-α基因PvuⅡ多態性與血清ALP測定結果 廣西壯族絕經婦女各ER-α基因PvuⅡ酶切基因組的血清ALP水平隨著年齡增大逐漸升高，60歲之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5個基因(PP，pp，Pp，P，p)在同一個年齡組的血清ALP水平無明顯差異(P>0.05)，而60歲之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因在同一年齡組與其他4個基因組(PP，pp，Pp，p)比較，血清ALP水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 ER-α基因PvuⅡ多態性與ALP測定結果

與其他4個基因同一年齡組比較：1)P<0.05，下表同

2.3ER-α基因PvuⅡ多態性與跟骨超聲BMD測定結果 廣西壯族絕經婦女各個ER-α基因PvuⅡ酶切基因組的右跟骨BMD隨著年齡增大BMD逐漸減小，60歲之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5個基因各個年齡組的BMD沒有明顯差異(P>0.05)，而60歲之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因與同一年齡組其他4個基因組比較，BMD明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 ER-α基因PvuⅡ多態性與BMD測定結果

2.4ER-α基因XbaⅠ多態性與ALP測定結果 廣西壯族絕經婦女各個ER-α基因XbaⅠ酶切基因組的血清ALP水平隨著年齡增大逐漸升高，65歲之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因5個基因(XX，xx，Xx，X，x)，各個年齡組的ALP水平沒有明顯差異(P>0.05)，而65歲之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年齡組與其他4個基因組(XX，xx，X，x)比較，ALP水平明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 ER-α基因XbaⅠ多態性與ALP測定結果

2.5ER-α基因XbaⅠ多態性與BMD測定結果 廣西壯族絕經婦女各ER-α基因XbaⅠ酶切基因組的右跟骨BMD隨著年齡增大BMD逐漸減小，65歲之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因，5個基因(XX，xx，Xx，X，x)，各個年齡組的BMD沒有明顯差異(P>0.05)，而65歲之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年齡組其他4個基因組(XX，xx，X，x)比較，BMD明顯提高(P<0.05)，見表4。

表4 ER-α基因XbaⅠ多態性與BMD測定結果

3 討 論

PMOP是老年性骨質疏松中最常見、臨床癥狀最嚴重的的一種。研究表明絕經后卵巢功能退化，合成和分泌內源性雌二醇水平下降〔5〕。但有些絕經女性骨質疏松的程度與內源性雌二醇水平下降不呈正比。這可能為ER敏感性問題，導致同一內源性雌二醇水平，表現出不同生理功能效應——骨質流失不同。而基因多態性與家族遺傳有關〔6～8〕。

本研究結果說明ER-α的PvuⅡ酶切基因對絕經婦女早期的血清ALP水平和BMD沒有明顯影響，而絕經晚期ER-α的PvuⅡ酶切的P等位基因婦女的血清ALP水平升高，說明骨代謝功能旺盛，成骨細胞功能下降，破骨細胞功能亢進，骨質流失加快，BMD降低。因為ALP是骨代謝最敏感指標〔9,10〕，所以P等位基因婦女更加容易患PMOP，應該提前防治。

本研究結果表明ER-α的XbaⅠ酶切基因對絕經婦女早期的ALP水平和BMD沒有明顯影響，而絕經晚期ER-α的XbaⅠ酶切的Xx等位基因婦女的ALP水平降低，說明骨代謝相對正常，成骨細胞功能和破骨細胞功能相對平衡，骨質流失得以抑制，BMD相對較高。Xx等位基因婦女絕經婦女不易患PMOP。

通過普查分析廣西壯族婦女絕經ER基因多態性與ALP水平和BMD大小的關系，找出導致ALP水平升高和BMD下降的ER基因，對易感人群提前防治，可以減少PMOP發病或減輕患病程度。