肝細胞癌循環腫瘤細胞的監測及其臨床意義

牛劍祥 宋瑞 王萬祥

(內蒙古醫科大學附屬醫院普通外科，內蒙古 呼和浩特 010050)

肝細胞癌(HCC)占全部肝癌的90%以上，是肝癌主要的病理類型〔1〕。HCC細胞惡性程度高，增殖轉移能力強，病情進展迅速，總體5年生存率僅5%左右〔2〕。目前手術切除仍是最主要的治療方法，轉移復發已成為阻礙HCC患者長期生存的關鍵〔3〕。外周血循環腫瘤細胞(CTCs)與多種腫瘤患者預后相關，CTCs數目可以反映腫瘤負荷，能用于檢測療效，且比標準的影像學改變更早〔4,5〕。但CTCs對于檢測HCC的發生、手術療效的評估及預測患者生存率的意義尚不明確，本研究應用基于生物素化去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的循環HCC分離/鑒定方法檢測CTCs，評價手術切除HCC組織對HCC治療及預后的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科2014年1月至2016年12月行手術治療的HCC患者60例，男27例，女33例；年齡23～80〔平均(55.7±9.4)〕歲；患者均為初發且術前未經任何形式的抗腫瘤治療，術后經病理證實為HCC。患者及其家屬知情同意。

1.2實驗材料 去唾液酸胎球蛋白、L-賴氨酸購自美國Sigma公司；Sulfo-NHS-1C-Biotin、二喹啉甲酸(BAC)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；抗生物素抗體磁珠、CK-3-6H5單克隆抗體購自德國Miltenyi公司；Ficoll-Paque PLUS 購自天津灝陽；二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自博士德公司；二步法免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；TritonX-100(即用型細胞通透劑)購自Amresco公司；CK-3-6H5購自德國Miltenyi公司；L535R型高速離心機；RT-6100型酶標分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；MS磁性分選柱、MACS磁性分選器購自德國Miltenyi公司。

1.3實驗方法 采用基于ASGPR的循環HCC細胞分離/鑒定系統及免疫組織化學技術檢測患者外周靜脈血中CTCs。真空采血針取患者術前、術后第1天及第7天肘正中靜脈血7.5 ml，并加入肝素抗凝，1∶1與生理鹽水混合均勻，加至3 ml細胞分離液層上，室溫下2 000 r/min離心20 min，吸取單個核細胞層，5 ml生理鹽水洗滌3次，室溫下2 000 r/min離心10 min。將外周血單個核細胞進行去唾液酸胎球蛋白生物素化標記。將二者混合并于37℃恒溫水浴箱孵育45 min磁性標記HCC，利用磁分選儀器分離，免疫組織化學染色鑒定，鏡下觀察：Hep Par 1 陽性，細胞呈橢圓形，棕黃色，細胞核完整，核質比高、體積大等特征。排除非特異染色的細胞和細胞碎片，符合上述特征的細胞為CTCs〔6〕。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1各時期CTCs陽性率比較 術后第7天CTCs陽性率〔15例(25.0%)〕顯著低于術前〔28例(46.7%)〕及術后第1天〔35例(58.3%)；χ2=6.125，13.714，P=0.013，P<0.001〕。

2.2術前CTCs陽性率與臨床資料的關系 術前CTCs陽性患者腫瘤直徑、數目及血管浸潤率均顯著高于陰性患者(P<0.05)，而年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)濃度、乙肝表面抗原(HbsAg)水平、腫瘤分化程度、Child分級差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3術前CTCs陽性率與患者預后的關系 術前CTCs陽性患者預后總生存時間明顯短于陰性患者(P<0.05)，見圖1。

表1 術前CTCs陽性率與臨床資料的關系〔n(%)〕

圖1 患者術前CTCs陽性率與患者預后的關系

3 討 論

CTCs多因腫瘤侵襲轉移作用或診療操作從實體腫瘤原發灶或轉移灶進入循環系統，是實現腫瘤轉移的關鍵步驟，研究顯示CTCs是乳腺癌細胞在小鼠模型體內發生肺轉移的基礎，同時CTCs陽性率高的乳腺癌患者預后及臨床表現不良〔7〕，且CTCs細胞群相比原發灶腫瘤細胞具有更強的上皮間充質轉化及干細胞表型，具有較強的惡性行為及耐藥能力〔8〕。目前許多研究指出，CTCs對腫瘤患者預后、復發風險及療效的評估具有潛在的指導價值，包括胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌及肝癌〔9～12〕，但CTCs與HCC病理分型進展及預后的關系尚無系統性研究。本研究結果提示CTCs陽性患者病情進展較深，由于未納入遠處轉移患者，故無法探究CTCs與患者遠處轉移的關系，但HCC腫瘤細胞的轉移與腫瘤直徑、數目及血管浸潤均存在密切聯系，肝癌的增殖分為多中心增殖和單中心增殖，即肝內腫瘤的多發生長及單發生長，多中心增殖更容易發生術后的復發轉移或肝內的自體轉移〔13,14〕。CTCs的遠處轉移方式有多種，且肝臟的血供比較豐富，術后的復發轉移率較高，其中以血行轉移最為普遍。腫瘤越大、數目越多、血管浸潤程度越深，發生CTCs的脫落及轉移復發率越高，本研究結果也從側面反映了CTCs對于HCC轉移的潛在指導作用。預后分析結果表明CTCs對HCC患者預后評估具有良好的應用價值。術后第1天患者CTCs檢出率出現小幅度升高，推測可能是在手術切除腫瘤組織過程中造成的機械損傷及應激等多重作用的影響下，導致HCC組織細胞的脫落進而進入循環系統，而術后第7天顯著降低可能是由于機械損傷及應激進入循環的HCC細胞為非自發進入循環的腫瘤細胞，與惡性生物學特性較強的CTCs群體存在本質差別，導致其被免疫系統清除，而手術治療可顯著減輕原發灶負荷，減少CTCs的來源，提示CTCs可在一定程度上反映HCC治療療效。

本研究表明，通過對外周血中CTCs 的檢測可以早期檢測HCC的發生、評估HCC手術治療的療效、監測HCC轉移及預測患者生存率，可能成為臨床治療HCC遠出轉移和復發的重要手段。