蒙古族2型糖尿病合并大血管病變與脂聯素基因啟動子區單核苷酸多態性的相關性

董艷慧 韓立坤

(內蒙古民族大學臨床醫學院，內蒙古 通遼 028000)

糖尿病(DM)大血管并發癥是導致2型糖尿病(T2DM)患者致殘、致死的主要原因，占所有DM患者死亡原因的59%〔1〕。因此，T2DM大血管并發癥的一級預防是DM治療中的一個重要方面〔2〕。有研究顯示脂聯素基因的錯義突變可導致血漿脂聯素水平下降，并認為這是T2DM的發病原因〔3，4〕；也有研究顯示脂聯素基因在大血管紊亂中扮演保護性角色，但是不同地區不同種族脂聯素基因表達不同〔5〕。既往的研究〔6〕多集中在脂聯素基因外顯子和內含子區，有關脂聯素基因啟動子區的基因多態性與T2DM大血管病變的研究較少。通遼市是蒙古族人口最集中的地區，T2DM發病率較高，故本研究旨在通過對脂聯素基因啟動子區SNP-11426(rs16861194)、SNP-11391(rs17300539)、SNP-11377(rs266729)3個位點上的基因型和等位基因頻率的分析，探討其多態性與蒙古族T2DM大血管病變的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2015年12月至2017年12月長期居住于內蒙古通遼市，在內蒙古民族大學附屬醫院門診或住院確診的四代以上均為蒙古族的患者430例，其中T2DM不合并大血管病變組(T2DM組)200例，男106例，女94例，平均年齡(45.91±12.18)歲；T2DM合并大血管病變組(T2DM+大血管病變組)230例，男127例，女103例，平均年齡(57.74±8.86)歲。T2DM診斷及分型依據1999年WHO的診斷標準。大血管病變的診斷標準〔7〕：(1)四肢大血管病變：經外周超聲檢查證實外周血管動脈粥樣硬化，有缺血性表現或閉塞、間歇性跛行、足背動脈消失、休息痛，甚至缺血性潰瘍或壞疽等臨床表現。(2)冠心病：有典型心絞痛或心肌梗死及心電圖表現者，或冠脈造影明確診斷者。(3)腦血管病：病史中出現偏癱或其他腦局灶性癥狀，且顱腦CT掃描或磁共振成像(MRI)顯示有缺血或出血改變者。入選對象均排除遺傳性疾病家族史及嚴重的全身系統疾病。本研究經內蒙古民族大學附屬醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書，同時通過詢問確保樣本間無血緣關系。

1.2方法

1.2.1一般資料及生化檢測 專人測量身高(cm)、體重(kg)，計算體重指數(BMI)，BMI=體重(kg)/身高(m)2。記錄飲酒史(是/否)、吸煙史(是/否)、血壓(mmHg)。空腹8 h后，清晨檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，空腹血糖(FPG)，空腹胰島素(FINs)、空腹C肽、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等指標。以上所有生化指標檢測試劑盒均由羅氏公司提供。

1.2.2外周血DNA提取 按照人血液基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物有限公司提供)說明書提取外周血DNA。

1.2.3PCR引物設計與擴增 從GenBank中查取人脂聯素基因序列，采用Oligo7軟件進行在線引物設計，由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列均為前向：5'ATCTCAACGGCCTAATGTGAC3',反向：5'GAAGTGGCAACATACAACACC3'。PCR反應體系：10倍Taq PCR緩沖液5.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl，上游引物2.0 μl，下游引物2.0 μl，Taq酶0.5 μl，MgCl22.5 μl，DNA模板2.0 μl，ddH2O 31.0 μl。反應條件：預變性95℃ 8 min;變性95℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，末端延伸72℃ 10 min，4℃保存，共進行35個循環，目的片段長約355 bp。

1.2.4測序與基因型的確定 擴增后有效的PCR產物，送北京三博遠志生物有限公司進行測序。

1.3統計方法 應用SPSS17.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗，等位基因頻率、基因型頻率采用直接基因計數法計算。計數資料單因素分析采用χ2檢驗。以Hardy-Weinberg平衡檢驗確定研究樣本的群體代表性。

2 結 果

2.1一般資料及生化指標比較 兩組性別分布、飲酒史、吸煙史、BMI、TC、LDL-C差異無統計學意義(P>0.05)；而T2DM+大血管病變組年齡、SBP、DBP、FPG、HbA1c、FINs、C肽、TG、HDL-C均高于T2DM組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組入選者一般資料及生化指標的比較

與T2DM組比較：1)P<0.05

2.2DNA提取與PCR擴增結果 提取的DNA及擴增后的PCR產物均行1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用GDS7500凝膠成像系統(UVP，德國)照相記錄，觀察分析結果，確保DNA及PCR產物質量。電泳圖顯示清楚，干凈無其他雜帶，見圖1、2。

圖1 人血液中提取的基因組DNA瓊脂糖電泳檢測其純度

圖2 基因組DNA的PCR擴增產物瓊脂糖電泳檢測其純度

2.3PCR產物測序結果 測序結果在NCBI網站的BLAST分析證實為目的脂聯素基因，與本研究SNP位點吻合，部分測序結果見圖3～5。

圖3 SNP-11377位點測序圖

圖4 SNP-11426位點測序

圖5 SNP-11391位點測序

2.4兩組脂聯素基因型頻率及等位基因頻率比較 T2DM+大血管病變組SNP-11426位點AA、AG、GG；SNP-11391位點GG、GA、AA；SNP-11377位點CC、CG、GG基因型頻率及等位基因頻率與T2DM組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 脂聯素基因各位點基因型頻率及等位基因頻率比較〔n(%)〕

3 討 論

脂聯素基因已經被證明是T2DM的易感基因〔8〕，其啟動子區域SNP位點通過調控脂聯素基因的轉錄影響脂聯素表達水平〔9〕，從而增加胰島素敏感性及具有抗炎等作用，能夠改善糖代謝和胰島素抵抗。有研究表明脂聯素基因還參與了T2DM大血管疾病的發生，在阻止T2DM大血管病變中扮演保護性角色〔10〕，但脂聯素基因與T2DM及并發癥的相關性存在種族、地域、環境、遺傳背景的差異。國內研究其與T2DM并發癥的關系多集中在脂聯素基因外顯子及內含子區域的SNP，如有研究表明脂聯素基因內含子區SNP+276(G>T)與T2DM大血管病變無關〔11〕。同時也有研究表明脂聯素基因外顯子區SNP+45(T>G)不是T2DM合并冠心病的關聯因素〔12〕。關于脂聯素基因啟動子區與T2DM及其并發癥關系的研究較少，多是單個橫斷面研究，如有研究提示脂聯素基因啟動子區SNP-11377(C>G)與T2DM患者肱踝脈搏波傳導速度正相關，進一步推斷其可能是T2DM大血管病變的易感基因〔13〕。還有研究表明脂聯素基因啟動區SNP-11377(C>G)與T2DM患者頸動脈中層厚度有關〔14〕。國外有一項研究沙特阿拉伯人脂聯素基因啟動子區SNP-11426(A>G)、SNP-11391(G>A)、SNP-11377(C>G)與T2DM合并冠心病無關〔15〕，而另一項加勒比非洲血統人類脂聯素基因啟動子區SNP-11391(G>A)與T2DM大血管病變的研究結果也表明二者無關〔16〕。以上結果不盡相同，進一步證明脂聯素基因多態性存在種族地域異質性。現國內尚缺乏有關蒙古族脂聯素基因與T2DM大血管病變風險關系的研究。本研究結果顯示其多態性與本地區蒙古族T2DM大血管病變無相關性，不是其患病的危險因素，可能與其他風險因素存在交叉作用。本研究結果也提示，隨著年齡的增加，為防止T2DM大血管病變的發生，臨床上應重視控制血糖、血壓、三酰甘油等水平，積極治療。本研究吸煙史與飲酒史兩組間無差別，與T2DM大血管病變危險因素分析〔17〕結果不一致，可能與選擇病例存在偏移有關。本研究觀察的樣本量尚少，有一定的局限性，有待進一步加大樣本進行更加深入的研究。