體外產氣法評價青貯大米草與玉米和豆粕的組合效應

(浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058)

當前限制我國畜牧業發展的關鍵因素就是缺乏優質牧草，因此開發新型的粗飼料資源刻不容緩。目前國內外在粗飼料資源上的研究應用主要集中在稻草、玉米秸稈、高粱、小麥秸稈等常見農作物秸稈上，而關于大米草(Spartinaanglica)應用于反芻動物飼養的研究報道較少。大米草自1963年被仲崇信[1]教授首次從英國成功引進中國以來，在保灘護堤、圍海造田等方面做出重要貢獻，但由于過度繁殖導致沿海生態系統與水產養殖遭到破壞，并威脅到沿海灘涂生態系統。而將其作為粗飼料資源來開發利用不僅能緩解沿海生態系統的壓力，也能有效支持中東部養殖業及相關產業的發展。王儀明[2]研究大米草全年整個生長期的營養成分后發現，大米草干草粗蛋白質含量大于8%，接近玉米、高粱、小麥的粗蛋白含量。而中性洗滌纖維含量達到67%。現有研究表明利用飼料之間的組合效應可改善飼料的利用效率，Silva等[3]發現反芻動物飼料間的組合效應往往在精飼料和粗飼料之間表現得最為明顯。蘇海涯[4]利用體外產氣技術研究桑葉與餅粕之間的組合效應時，發現組合效應值的綜合指標(AEs)可有效評定飼料原料之間的組合效應。本試驗通過體外產氣技術研究青貯大米草與玉米/豆粕的優化組合，確定最優的搭配組合，為大米草飼料化利用提供科學依據與理論參考。

1 材料與方法

1.1試驗原料 大米草采自杭州灣灘涂區域(刈割青貯大米草地上部分，長度約50～80 cm)，青貯結束后烘干，40目粉碎備用，玉米、豆粕從市場購入，3種原料的常規營養成分按楊勝[5]的方法進行測定，即：干物質(dry matter，DM)用烘干法測定，粗蛋白(crude protein，CP)用凱氏定氮法測定，粗脂肪(ether extract，EE)用乙醚提取法測定，粗灰分用高溫(550～600 ℃)，灰化法測定，鈣(calcium，Ca)用高錳酸鉀滴定法測定，磷(phosphorus，P)用釩鉬酸銨比色法測定，而NDF和ADF則用Van Soest等[6]的方法測定，結果見表1。

表1 飼料原料的常規營養成分(絕干基礎，%)

1.2試驗設計 試驗共分為9個處理：將玉米比例(0%，15%，30%)和豆粕比例(0%，15%，30%)進行組合，其余為青貯大米草比例，詳見表2。

表2 各處理的底物組成(%)

1.3試驗方法

1.3.1瘤胃液供體 晨飼前取自3頭裝有永久性瘤胃瘺管的湖羊，4層紗布過濾后置于39 ℃水浴保溫，并持續通入CO2飽和備用。

1.3.2體外培養 人工唾液按照Menke[7]等的方法配置。試驗采用Mauricio等[8]的壓力讀取式體外產氣系統進行體外瘤胃發酵培養。按各處理組的比例準確稱500 mg底物至120 mL產氣瓶中，在持續通入CO2氣流下加入45 mL人工唾液，密封后在39℃恒溫培養箱中預處理培養12 h。次日早晨抽取用四層紗布過濾后的瘤胃液5 mL加入到產氣瓶中，每個處理設4個重復，培養時間均為48 h，試驗重復進行2次。

1.4指標測定及方法 48 h后，立即取出將發酵瓶從恒溫培養箱取出置于準備好的冰盒中，終止發酵，開瓶測定pH，并且快速分裝發酵液，冷凍備測其他發酵參數。

pH：發酵終止后，立即開瓶，使用SartoriusPB-20型pH計測定。

揮發性脂肪酸(VFA)：使用氣相色譜儀(GC-2010，Shimadzu)測定乙酸、丙酸、丁酸和總揮發性脂肪酸的含量。

氨態氮(NH3-N)：取上清混合液，采用比色法測定NH3-N濃度[9]。

微生物蛋白(MCP)：采用Makkar[10]的試驗方法，用嘌呤法測定微生物蛋白(microbial protein production)產量。

產氣量(GP)：按Menke等[7]的方法計算

式中，GPt為樣品在t時間段的產氣量(mL)；Pt為t時間段讀取的壓力(kPa)；V0為瓶子體積；101.3為標準大氣壓(kPa)；W為樣品干物質重。總產氣量為各時間段產氣量之和。

產氣量和體外有機物消化率：根據蘇海涯[4]的方法估算產氣量(gas production，GP)和體外有機物消化率(organic matter digestibility，OMD)。飼料樣品在瘤胃體外發酵的消化率與在綿羊體內的消化率呈顯著正相關，體外有機物消化率由產氣量的估計公式為：

OMD(%)=0.7602GP+0.635CP+22.5

該式中，GP指48 h產氣量(mL)，CP指飼料干物質中粗蛋白含量(%)。

產氣參數：利用‘fit curve’軟件，根據?rskov[11]的產氣模型公式將各種樣品在2、4、6、9、12、24、36、48時間點的產氣量代入，計算消化動力參數。模型公式為：

GP=a+b(1-exp-ct)

其中GP是在t時間的產氣量，a為快速產氣部分，b為緩慢產氣部分，c為b的產氣速度常數，a+b為潛在產氣量。

組合效應值和綜合組合效應值(synthetic associate effects，AEs)：根據蘇海涯[4]的方法計算組合效應值和綜合組合效應(AEs)值。

式中，實測值為實際測定的樣品生產量(mL)，加權估算值=青貯大米草的實測值×青貯大米草配比(%)+玉米實測值×玉米的配比(%)+豆粕實測值×豆粕配比(%)。

式中，GP實測值、MCP實測值分別為發酵體系中實際測定的產氣量(mL)和微生物蛋白生成量(mg)；SUBGP為用于生成氣體所需的飼料底物樣品質量(mg)，SUBGP=2.27(mg/mL)×GP(mL)，其中2.27為每生成1 mL氣體平均所需的飼料底物樣品數量(根據Blummel等[12]研究:2.20～2.34 mL)；SUBMP為用于生成微生物所需的飼料底物樣品質量(mg)，SUBMP=微生物蛋白(mg)/0.625，其中0.625為微生物干物質中蛋白質的含量。

1.5統計分析 試驗數據經Excel2010初步整理，用SPSS 17.0軟件處理，經GLM模型進行二因素方差分析，采用鄧肯氏法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1青貯大米草與玉米和豆粕組合對發酵參數的影響 詳見表3。

表3 青貯大米草與玉米、豆粕組合對發酵參數的影響

注：同列數據標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

由表3可知，第9組的NH3-N濃度、MCP濃度、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度均顯著高于其他組(P<0.05)。玉米對所有的發酵參數均有極顯著影響(P<0.01)，豆粕除對pH沒有影響外，在其他發酵指標上均有極顯著影響(P<0.01)，但玉米和豆粕對各發酵參數均未產生交互作用(P>0.05)。隨著玉米的比例的升高，發酵體系中的總VFA、乙酸、丙酸、丁酸的生成量均升高，但乙丙比呈下降趨勢。

2.2青貯大米草與玉米、豆粕組合對組合效應的影響 詳見表4。

表4 青貯大米草與玉米、豆粕組合對產氣參數及組合效應的影響

注：GP是t時間的產氣量；其中，a是快速產氣部分，b是慢速產氣部分，c是b的產氣速率常數，a+b為潛在產氣量。

從表4可以看出，第9組的48 h產氣量、潛在產氣量、體外有機物消化率均顯著高于其他組(P<0.05)，而第6組的48 h GP、總VFA均顯著高于其他組。第6組綜合組合效應(AEs)最高，但MCP、NH3-N的組合效應值與其并不一致，且OMD的組合效應值在第5組中最高；玉米對48 h GP、a+b和MCP、NH3-N及OMD的組合效應值有極顯著影響(P<0.01)，對總VFA的組合效應值有顯著影響(P<0.05)，但對綜合組合效應無影響(P>0.05)，豆粕對a+b、48 h GP和總VFA的組合效應值沒有顯著影響(P>0.05)，對其他產氣參數均有極顯著影響(P<0.01)；玉米和豆粕對各產氣參數、各指標的組合效應值和綜合組合效應值(AEs)均有顯著的交互影響(P<0.05)。

3 小結與結論

3.1不同比例組合對pH、NH3-N、MCP的影響 瘤胃pH是綜合體現瘤胃微生物活動狀況的一個重要指標，相對穩定的pH也是瘤胃正常發酵的前提。Marden等[13]研究認為，瘤胃的較適宜pH在6.37～6.93之間，本研究中所測得的pH均在此報道范圍內；在本試驗中，隨著玉米和豆粕比例的升高，pH呈現出下降趨勢。隨著玉米比例的提高，碳水化合物分解加速使pH降低，但隨著豆粕比例的升高，各處理的pH沒有出現顯著變化，說明可以通過調控日糧中玉米的比例來調控瘤胃pH。

瘤胃中NH3-N是飼料在瘤胃中被消化分解的終產物之一，同時也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料。飼料原料不同，瘤胃中氨態氮濃度也會有較大波動。McDonald等[14]研究發現瘤胃最佳的氨態氮濃度在5～25 mg/dL，但鄭琛等[15]則認為瘤胃最佳的氨態氮濃度在10～50 mg/dL，Yang等[16]發現給奶牛補飼蛋白質飼料能提高瘤胃氨態氮濃度，這與本試驗研究一致。本試驗中的NH3-N濃度在15.88～37.90 mg/dL之間，其中，第3、6、9組的NH3-N濃度顯著高于其他組，這主要是因為這3組的豆粕比例較高，由于富含蛋白質的豆粕在被消化分解后產生的高濃度氨態氮未被微生物充分利用導致體系中濃度升高。

MCP為反芻動物瘤胃微生物重要的蛋白原料，可反映發酵體系中微生物對NH3-N的利用效率。瘤胃合成的MCP占小腸可吸收氨基酸的50%～80%[17]，是反芻動物重要的蛋白原料，當瘤胃中氮和能量釋放不同步時，均可導致飼料底物的利用率下降和MCP合成水平的降低。在本試驗中，隨著玉米豆粕比例的增加，瘤胃微生物的含量也隨之升高，可能原因是因為玉米、豆粕比例的增加提高了體系的能量水平，為微生物的繁殖提供了充足的能量和氮源，有利于微生物的大量繁殖，這也意味著可以通過控制玉米、豆粕的比例來調控MCP的合成。

3.2不同比例對組合效應的影響 瘤胃液中的VFA是反芻動物碳水化合物在瘤胃的降解產物，乙酸是反芻動物合成脂肪的原料，丙酸是瘤胃中唯一能生糖的有機酸，其濃度可反映瘤胃的能量利用效率，丙酸通過糖異生途徑產生的葡萄糖可供反芻動物代謝需要，而乙丙比則代表了瘤胃的發酵模式。Kljak等[18]研究發現，當日糧中精料部分提高時，瘤胃中的乙丙比有下降的趨勢，這與本試驗研究一致。本試驗中，在第9組的總VFA、乙酸、丙酸、丁酸均極顯著高于其他各組，原因是該組的玉米、豆粕比例較高，為反應體系提供了更多的碳水化合物底物且提高了纖維消化率，而試驗6組VFA組合效應顯著高于其他各組，為最佳組合，表明在日糧搭配方面可以充分利用組合效應這一優勢，讓有限的飼料原料，發酵后產生最多的VFA來為反芻動物提供更多能量。

結合飼料的體外產氣量和化學成分來估算的消化率與體內測定的消化率有高度相關性，而瘤胃體外發酵的產氣量也與飼料的體內消化率呈正相關。Castrillo等[19]研究發現升高精料比例和飼糧中添補大麥，綿羊瘤胃OM的降解率升高，這與本試驗研究基本一致。本試驗中，隨著玉米、豆粕的比例提高，OMD總體呈上升趨勢，其中第9組OMD、產氣量與潛在產氣量均極顯著高于其他組，表明該組的消化率最高。在OMD組合效應方面，第5組的OMD組合效應顯著高于第6組，但因本試驗并未對發酵氣體成分和終產物微生物種群及數量進行取樣分析，而事實上，反芻動物消化系統的內環境也是處于動態平衡之中，因此其作用機制和微生物菌群分布情況還有待進一步探索。

3.3結論 在本試驗條件下，以48 h產氣量、TVFA組合效應、OMD和綜合組合效應值等為主要衡量指標，當青貯大米草∶玉米∶豆粕比例為55∶15∶30時的能氮平衡較好，組合效應最為明顯，可以使瘤胃發酵最佳，為本試驗的最優組合，適當調整日糧精粗比可改善青貯大米草的利用效率，是推進青貯大米草規模化飼料利用的有效途徑。