高效液相色譜法測定枇杷葉膏中綠原酸含量

辜俊鑫 ，辜 瑜 ，張學霞 ，魏曉玲 ，王成瓊 ，曾 容 ，譙春燕

（1.北京同仁堂科技發展成都有限公司，四川 成都 610100； 2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

枇杷葉膏收載于2015年版《中國藥典（一部）》，由 枇杷葉經水煮濃縮加煉蜜或蔗糖溶化，再濃縮到規定的相對密度即得，具有清肺潤燥、止咳化痰的功效。其質量標準中的檢驗項目有性狀、相對密度、不溶物、裝量及微生物限度，無成分的定量項，不能客觀地反映產品的質量控制情況。為解決枇杷葉膏生產過程中的枇杷葉前處理和提取，并開發出用于提取車間申報的定量分析方法。前期分析了熊果酸、齊墩果酸[1]、兒茶素、苦杏仁苷、槲皮素、山柰素[2－3]和綠原酸[4]，發現有的成分含量太低，不適合定量分析，有的成分在不同藥材中的重復性不好，時有時無，最終確定以綠原酸作為定量指標。本研究中采用高效液相色譜法測定枇杷葉膏中的綠原酸含量，作為其質量控制指標之一。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技＜中國＞有限公司）；T9S紫外－可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；MS205DU型電子天平（梅特勒－托利多公司）；AS10200B型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（色譜純，Fisher公司）；磷酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為自制二次重蒸餾水；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753－201716，含量為99.3%）；枇杷葉膏（市售品，批號分別為17132754，17132755，17132756）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Amethyst C18－H 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.4% 磷酸溶液（10 ∶90）；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃ ；流速：1.0 mL ／min；進樣量：10 μL。在擬訂色譜條件下綠原酸的分離度在 3.0以上，對稱因子為1.02，理論板數以綠原酸峰計不低于15 000。以峰面積外標法定量。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

稱取枇杷葉膏4.2 g，置100 mL容量瓶中，加入甲醇 －水（50 ∶50）約 80 mL，超聲溶解 30 min，放冷至室溫，再用甲醇 －水（50∶50）定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇 －水（50 ∶50）制成每 1 mL 含 40 μg的對照品溶液。按制備工藝方法制備不含枇杷葉的陰性樣品，按上試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件各進樣10 μL測定。記錄色譜圖。可見，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液相應位置處有相應色譜峰，陰性對照無干擾。

線性關系考察：取 10.32 mg經五氧化二磷（P2O5）干燥12 h后的綠原酸對照品，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇－水（50∶50）超聲溶解并定容至刻度，作為綠原酸對照品貯備液。分別吸取綠原酸對照品貯備液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇 －水（50 ∶50）制成質量濃度分別為 20.495 52，30.743 28，40.991 04，51.238 8，61.486 56，71.734 32 μg ／mL 的溶液，按擬訂色譜條件測定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、綠原酸進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝3 149.4 X＋8.164 1，r＝0.999 9（n＝6）。結果表明，綠原酸進樣量在 0.204 955 2 ～ 0.717 343 2 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，精密吸取10 μL，重復進樣 6次，測定峰面積。結果的 RSD為 0.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液并測定綠原酸含量。結果的 RSD為1.2%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于室溫條件下放置10 h，每隔2 h進樣1次，測定峰面積。結果的 RSD為0.83%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內穩定。

加樣回收試驗：取綠原酸對照品10.65 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇－水（50∶50）超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液（綠原酸質量濃度為 105.754 5 μg ／mL）；精密稱取已知含量的樣品（批號為17132754）適量，共6份，分別加入上述對照品溶液6.0，6.0，12.0，12.0，18.0，18.0 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，并精密稱取綠原酸對照品適量，同法制成質量濃度為40 μg／mL的對照品溶液，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，用外標法計算含量。結果見表2。

表2 3批樣品中綠原酸含量測定結果（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

在選擇檢測波長時，取綠原酸對照品溶液，用甲醇－水（50∶50）為空白溶劑，經紫外－可見分光光度計掃描，綠原酸在328 nm波長下有最大吸收，參考《中國藥典》金銀花中綠原酸的檢測波長為327 nm[5]，故確定327 nm作為綠原酸的檢測波長。曾以乙腈－0.4%磷酸溶液（13∶87）為流動相，但樣品分離度和主峰形不好；用乙腈－0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動相時，主峰形對稱，分離效果好。由于枇杷葉膏很黏稠，用甲醇－水（50∶50）超聲溶解時，不定時振搖有助于樣品溶解；比較超聲20 min和30 min的效果發現，超聲30 min時提取完全，故最終采用甲醇－水（50∶50）超聲溶解30 min。方法學考察結果表明，所建立的方法回收率、精密度、重復性均符合2015年版《中國藥典（四部）》藥品質量標準分析方法驗證指導原則的相關規定[6]，且操作簡便、快捷，本方法的建立，可彌補現行藥典標準中無成分定量的現狀，有利于更好地提高和控制枇杷葉膏的藥品質量。

3.2 不足

枇杷葉中綠原酸受各地環境不同、生長時間長短、采收加工時間不同、加工工藝不同影響，其含量會有差異，導致成品枇杷葉膏中綠原酸的含量差異較大。故未對枇杷葉膏中綠原酸的含量做出建議值，如要規定其含量值，應更多地考察和研究枇杷葉在不同產地、不同加工時間段、不同生產工藝對綠原酸的影響，同時比較不同廠家生產的枇杷葉膏的綠原酸含量及綠原酸在枇杷葉膏中的穩定性，為確定一個科學、有效、客觀的含量值，提供更多、更全面、更公正的數據。

本研究中還發現，與綠原酸面積歸一百分比相近的還有3個主要成分峰，如能確定其中1個成分峰，使用2個成分指標定量，將更有利于提高枇杷葉膏質量標準。