高效液相色譜－蒸發光散射法測定絞股藍中絞股藍皂苷XLIX含量

胡曉安，高 翔 ，胡萌萌 ，徐世明 ，喬蓉霞 ，馬鵬飛

（1.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710061； 2.北京大學安康藥物研究院，陜西 安康 725000）

絞股藍 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino，又名七葉膽[1]、遍地生根、公羅鍋底、小苦藥、五葉參等[2－3]，為葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本植物[4]，主要分布于秦巴山區及長江流域以南廣大地區[5]。絞股藍中含皂苷、多糖、黃酮、甾醇類、氨基酸及微量元素等多種化學成分[6－7]。其質量標準收載于《陜西省中藥飲片標準（第三冊）》和2009年版《湖南省中藥材標準》，均無含量測定項目，是因為無可用于含量測定的法定對照品。國家藥典委員會2010年提出絞股藍藥材質量標準提高研究任務，研究制訂絞股藍質量標準。陜西省食品藥品監督檢驗研究院從2009年起對絞股藍皂苷XLIX對照品的制備、結構鑒定進行了深入研究，制備的對照品于2017年9月通過中國食品藥品檢定研究院的審核與標定，現已發售。本研究中采用高效液相色譜－蒸發光散射（HPLC－ELSD）法測定絞股藍皂苷XLIL對照品的含量，該法簡單快速、專屬性強、重復性良好。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Allance 2690型高效液相色譜儀（Waters公司）；2000ES型蒸發光散射檢測器（Alltech公司）；M2P型電子天平（十萬分之一），BP61型電子天平（萬分之一），均購自德國賽多利斯公司；KQ5200E型超聲波清洗器（常州諾基儀器有限公司）。

試藥：絞股藍皂苷XLIX對照品（批號為112033－201701，標示含量為94.4%，購自中國食品藥品檢定研究院）；絞股藍藥材選取產地為陜西平利縣北京大學安康藥物研究院絞股藍種植基地（通過國家GAP認證），批號分別為 20080302，20100523，20161126，經徐世明教授鑒定為葫蘆科植物絞股藍 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino；乙腈、甲醇（TEDIA 公司）為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Dubhe C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱溫：室溫；檢測波長：203 nm；流速：1 mL ／min；流動相：乙腈（A） － 超純水（B），梯度洗脫（見表 1）。用蒸發光散射檢測器檢測，流速為2.7 L／min，霧化溫度為99.7℃。理論板數按絞股藍皂苷XLIX峰計算大于5 000。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

稱取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含絞股藍皂苷XLIX 0.4 mg的溶液，即得對照品溶液。取絞股藍新鮮全草，晾干，粉碎處理，過四號篩后，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，精密量取上清液25 mL，揮干，殘渣用甲醇溶解并移至5 mL容量瓶中，定容，搖勻，濾過，取續濾液[8]，即得供試品溶液。

2.3 測定法

精密吸取對照品溶液15 μL和25 μL，供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法對數方程計算。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜－蒸發光散射色譜圖

2.4 方法學考察

線性關系考察：精密吸取對照品溶液（質量濃度為0.412 3 g ／L）5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積值，以進樣量的自然對數值為橫坐標（X）、峰面積的自然對數值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程 Y＝1.718 6 X＋4.667 7，r2＝0.998 2（n＝6）。結果表明，股藍皂苷XLIX進樣量在2.061 5～12.936 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液15 μL，在擬訂色譜條件下，連續進樣5次。結果絞股藍皂苷XLIX峰面積值的 RSD為1.45%（n＝5），表明儀器精密度好。

穩定性試驗：稱取絞股藍皂苷XLIX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含絞股藍皂苷XLIX 0.4 mg的溶液，另取樣品（批號為20161126）按2.2項下供試品溶液方法制備，分別放置 0，1，2，4，6，7 h 時各進樣20 μL，測定絞股藍皂苷 XLIX的峰面積。結果的 RSD分別為1.32%和1.75%（n＝6），表明對照品溶液和供試品溶液均在7 h內穩定。

重復性試驗：取樣品6份（批號為20080302）粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，按2.2項下供試品溶液方法制備，依法測定含量。結果絞股藍皂苷XLIX平均含量為0.76%，RSD 為 0.94% （n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取本品（批號為20080302，絞股藍皂苷 XLIX含量為 0.76%）粉末（過四號篩）約 0.6，0.5，0.4 g，各 3 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入絞股藍皂苷XLIX甲醇溶液（質量濃度為0.748 g／L）各 4.0，5.0，6.0 mL，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，依法測定含量，計算回收率。結果見表2。

表2 絞股藍皂苷XLIX加樣回收試驗結果（n＝9）

2.5 樣品含量測定

取不同批號的絞股藍，同法制備供試品溶液，依法測定，以外標兩點法對數方程計算含量。結果批號為20080302，20100523，20161126的樣品平均含量分別為0.76% ，0.58% ，0.51% ， RSD 分別為 0.94% ，1.41% ，1.35（n ＝3）。

3 討論

絞股藍皂苷XLIX具有四環三萜的達瑪烷型結構[9－10]，紫外最大吸收波長為203 nm[11]，紫外檢測器響應值低、干擾大，而蒸發光散射檢測器具有專屬性好、本底噪聲小、檢測相應值高等特點[12－13]。

絞股藍皂苷含有多種化學成分且具有多種藥理作用[14－15]，目前已分離得到136種[13]。藥理學動物實驗證明，其主要有效成分是絞股藍皂苷XL1X和絞股藍皂苷A[12－13，16]。因此，應探討以絞股藍皂苷 XLIX 和絞股藍皂苷A作為標準品進行質量標準的研究。

流動相分別考察了甲醇－水、乙腈－水系統的分離情況，比較絞股藍皂苷XLIX峰形、分離度可知，乙腈－水系統優于甲醇－水系統。適當調整乙腈－水的梯度洗脫比例，樣品中所有峰均可在20 min內出峰完畢。

專屬性考察采用液相色譜－質譜（LC－MS）法進行峰純度檢查。使用 Aglient 1200型高效液相色譜儀，Bruker HCT大容量離子阱質譜儀，依法制備供試品溶液和對照品溶液，注入LCMS比較兩者絞股藍皂苷XLIX峰的相對分子質量，結果表明，對照品與供試品溶液中絞股藍皂苷XLIX相應保留時間出峰的化合物具相同的相對分子質量，供試品絞股藍皂苷XLIX峰中未夾雜其他雜質，表明該法專屬性良好。